外植体灭菌 — 植物组织培养实验方案

 常用的植物组织培养消毒剂

 

消毒剂 产品编号 浓度(%) 暴露时间(min)
次氯酸钙 211389 9-10 5-30
次氯酸钠 425044 0.5-5 5-30
过氧化氢 H1009 3-12 5-15
乙醇 E7148 70-95 0.1-5.0
硝酸银 S7276 1 5-30
氯化汞 M1136 0.1-1.0 2-10
苯扎氯铵 B1383 0.01-0.1 5-20
*商业漂白剂含有约5%的次氯酸钠,因此可以以10-20%的浓度使用,其相当于0.5-1.0%的次氯酸钠。

灭菌程序可以通过以下方式加强:

  1. 在用另一种消毒剂溶液处理之前,将材料置于70%乙醇溶液中。已证明使用两步(双源)灭菌程序对某些物种有益。
  2. 可以在消毒剂中加入润湿剂,如TWEEN® 20或80(产品编号:P1379 或 P1754),以降低表面张力,使表面更好接触。
  3. 在真空下进行灭菌过程。这样可以去除气泡,并提供更有效的灭菌过程。

 兰花种子灭菌

兰花种子非常小,几乎没有食物储备。
 单个种囊可含有1,500至3,000,000个种子。试管播种可使萌发未成熟的种子(绿荚)成为可能。
 在种囊裂开后,对绿色种囊灭菌比对单个种子灭菌更容易。 Lucke(1971)指出,当种囊达到约三分之二成熟度时,可以对兰花种子灭菌。下面列出了各种兰花品种种囊的估计正常成熟时间(Lucke,1971)。

 

兰花属 成熟时间(月)
石豆兰 3
虾脊兰属 4
卡特兰属 11
贝母兰属 13
蕙兰属 10
杓兰属 3.5
石斛 12
树兰属 3.5
蕾丽亚兰 9
三尖兰属 3.5
堇花兰属 9
齿瓣兰属 7
兜兰属 10
蝴蝶兰属 6
奇唇兰属 7
万代兰属 20

 

绿色种囊灭菌

  1. 将种囊浸泡在100%漂白溶液中30分钟。
  2. 将种囊蘸取95%酒精并点燃。
  3. 在无菌条件下,打开种囊,刮出种子。
  4. 小心地将种子铺在培养基表面上

干种子灭菌

  1. 收集种子并放入小瓶或瓶中,或置于缩短的移液管中,移液管的一端用棉花密封。将种子放入移液管后,用棉花密封 移液管的另一端。
  2. 制备含有5-10%市售漂白剂的溶液,其中含有几滴TWEEN 20。
  3. 将漂白剂溶液加入烧瓶中,或将溶液吸入移液管。旋转含有种子和漂白剂的烧瓶,或者用移液管反复吸取和排出漂白剂溶液。
  4. 将种子消毒5-10分钟。
  5. 去除漂白剂溶液,用无菌组织培养级纯水冲洗种子。
  6. 将种子转移到无菌培养基中。