Extract-N-Amp™组织PCR试剂盒方案

货号: XNAT2, XNAT2R

 

产品描述

Extract-N-Amp组织PCR试剂盒包含从小鼠尾巴和其他动物组织、口腔拭子、毛干和唾液中快速提取和扩增基因组DNA所需的所有试剂。简而言之,将样品与提取液和组织制备溶液的混合物室温孵育10分钟,从而将DNA从原料中释放出来。无需进行机械破碎、有机提取、柱纯化或DNA沉淀。

加入中和液B后,提取物即可进行PCR。然后将等份的中和提取物与Extract-N-Amp PCR反应混合物和用户提供的PCR引物混合进行靶DNA扩增。Extract-N-Amp PCR反应混合物是2X预混合物,含有缓冲液、盐、dNTP和Taq聚合酶。为了与提取试剂一起使用,专门对其进行了优化。它还含有JumpStart™ Taq抗体,可增强热启动PCR的特异性,但不含REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物中的惰性红色染料。

 

提供的试剂 货号 XNAT2
100次制备,100次PCR
XNAT2R
100次制备,100次PCR
提取液 E7526 24 ml 240 ml
组织制备液 T3073 3 ml 30 ml
中和液 B N3910 24 ml 240 ml
Extract-N-Amp PCR反应混合物
这是含有缓冲液、盐、dNTP、Taq聚合酶和JumpStart Taq抗体的2X PCR反应混合物
E3004 1.2 ml 12 ml


需自备的试剂和设备


注意事项和免责声明

本产品仅供研发使用,不用于药物、家用或其他用途。有关危险和安全处理方法的信息,请参阅安全数据单页。


储存

Extract-N-Amp组织PCR试剂盒可在2至8 °C下储存3周。超过3周长期储存时,建议-20 °C储存。请勿储存于“无霜”冰箱中。


操作步骤

除非另有说明,否则所有步骤均在室温下进行。

A. 从小鼠尾巴、动物组织、毛发或唾液中提取DNA

  1. 吸取100 µL提取液到微量离心管或多孔板的孔中。向管或孔中加入25 µL组织制备液,上下吹打混合。
    注意:如果需要多次提取,可以在用前2小时以4:1的比例预先混合足量的提取液和组织制备液。
  2. 2a. 新鲜或冻存的小鼠尾巴:在使用之前和更换样品时用70%乙醇冲洗剪刀和镊子。将0.5-1 cm的小鼠尾尖(切掉端部)放入溶液中。涡旋或吹打,彻底混合。确保鼠尾浸在溶液中。
    注意:新鲜鼠尾在剪下后30分钟内提取。
    2b. 动物组织:在使用之前和更换样品时用70%乙醇冲洗剪刀或手术刀和镊子。将2-10 mg组织放入溶液中。涡旋或吹打,彻底混合。确保组织浸在溶液中。
    2c. 毛干:在使用之前和更换样品时用70%乙醇冲洗剪刀和镊子。修剪掉多余的毛干,只留下根部,将样品(根端向下)放入溶液中。每次提取只需要一根带根的毛干。
    2d. 唾液:吸取10 µL唾液到溶液中。涡旋或吹打,彻底混合。
    2e. 卡片上干燥的唾液:吸取50 µL唾液到收集卡上,并干燥卡片。在使用之前和更换样品时用70%乙醇冲洗冲头。从干燥的唾液样品区域钻出一圆片(最好是1/8英寸或3 mm)。将圆片放入溶液中。轻拍管或板的硬表面,确保孵育期间圆片浸在溶液中。
  3. 将样品室温孵育10分钟。
  4. 将样品95 °C孵育3分钟。
    注意:孵育结束时组织不会完全消解。这是正常现象,不会影响效果。
  5. 向样品中加入100 µL中和液B,涡旋混合。
  6. 将中和的组织提取物4 °C储存或立即用于PCR。继续C部分第1步。
    注意:长期储存时,弃去未消化的组织或将提取物转移到新的试管或孔中。提取物可4 °C储存至少6个月,大多数情况下不会有明显的损失。

 

B. 从口腔拭子提取DNA

  1. 从拭子上收集口颊细胞,并干燥拭子。干燥时间约为10至15分钟。
    注意:由于DNA提取液的量较少,应使用泡沫拭子。避免使用纤维(如棉花或涤纶)拭子,因为溶液无法得到有效回收。
  2. 吸取200 µL提取液到微量离心管中。向管中加入25 µL组织制备液,上下吹打混合。
    注意:如果需要多次提取,可以在用前2小时以8:1的比例预先混合足量的提取液和组织制备液。
  3. 将干燥的口腔拭子放入溶液中,室温孵育1分钟。
  4. 将拭子在溶液中旋转10次,然后将拭子紧贴管侧旋转,从而挤出拭子中多余的溶液。弃去拭子。盖上管子,短暂涡旋。
  5. 将样品室温孵育10分钟。
  6. 将样品95 °C孵育3分钟。
  7. 向样品中加入200 µL中和液B,涡旋混合。
  8. 将中和的提取物4 °C储存或立即用于PCR。继续C部分第1步。
    注意:提取物可4 °C储存至少6个月,大多数情况下不会有明显的损失。


PCR 扩增

Extract-N-Amp PCR反应混合物含有JumpStart Taq抗体,可用于特定的热启动扩增。因此,PCR反应可以在室温下进行而不会过早产生Taq DNA聚合酶活性。

最终引物浓度通常约为0.4 µM。最佳引物浓度和循环参数取决于所使用的系统。

1.  将以下试剂加入薄壁PCR微量离心管或板中:

 

试剂 体积
PCR级水 x µL
Extract-N-Amp PCR反应混合物 10 µL
正向引物 y µL
反向引物 y µL
组织提取物 4 µL*
总体积 20 µL

*注意:Extract-N-Amp PCR反应混合物配方用于补充提取液、组织制备液和中和液中的组分。如果添加到PCR反应体积中的组织提取物少于4 µL,用50:50的提取液:中和液B混合物使组织提取物的体积达到4 µL。

2.    轻轻混匀。

3.    如果热循环仪没有加热盖,需在每管混合物的上部加入20 µL矿物油防止蒸发。

4.    进行热循环。应针对各个引物、模板和热循环仪优化扩增参数。

常见的循环参数:

 

步骤 温度 时间 循环次数
预变性 94 °C 3 分钟 1
变性 94 °C 0.5-1 分钟 30-35
退火 45 to 68 °C 0.5-1 分钟
延伸 72 °C 1-2 分钟
(~ 1 kb/min)
最后延伸 72 °C 10 分钟 1
保温 4 °C 不确定  

 

5.    PCR结束后,将扩增的DNA加到琼脂糖凝胶上,并加入单独的上样缓冲液/示踪染料,如凝胶上样溶液(货号G2526)
        注意:如果需要,可对PCR产物进行纯化,用于下游应用,例如使用GenElute™ PCR纯化试剂盒(货号NA1020)进行测序。

 

相关产品 货号
乙醇 E7148; E7023; 459836
微解剖用的镊子 F4267
PCR 标记 P9577
PCR 微型管 Z374873; Z374962Z374881
PCR 多孔板 Z374903
预制琼脂糖凝胶 P6097
密封垫和密封胶带 Z374938; A2350
TBE 缓冲液 T4415, T6400, T9525


故障排除指南

 

问题 原因   解决方案  
检测到很少或检测不到PCR产物。 组织提取物污染物抑制PCR反应。 用50:50的提取液和中和液混合物稀释组织提取物。为了检测抑制作用,需有DNA对照,并且/或者将已知量的模板(100-500个拷贝)与组织提取物一起进行PCR。
提取不充分。 将样品55 °C孵育10分钟,而不是室温孵育。
PCR组分丢失或降解。 运行阳性对照,确保组份正常有效。另外,构建反应时建议使用检查表。
执行的循环太少。 增加循环次数(每次增加5-10个循环)。
退火温度太高。 将退火温度以2-4 °C增量递减。
引物设计不佳。 确认序列信息准确。如果引物长度小于22个核苷酸,试着将引物延长到25-30个核苷酸。如果引物的GC含量低于45%,重新设计GC含量为45-60%的引物。
变性温度太高或太低。 将变性温度以1 °C增量递增或递减来进行优化。
变性时间太长或太短。 将变性时间以10秒增量递增或递减来进行优化。
延伸时间太短。 将延伸时间以1分钟增量递增,尤其是对于长模板。
靶标模板复杂。 大多数情况下,由于GC含量异常高和/或二级结构,靶标本就复杂。据报道,浓度为1.0-1.7 M的甜菜碱(货号B0300)有助于扩增GC含量高的模板。
多种产物 JumpStart Taq抗体无法正常作用。 不要将DMSO或甲酰胺与Extract-N-Amp PCR反应混合物一起使用。它会干扰酶-抗体复合物。其他助溶剂、溶质(如盐)和pH或其他反应条件的极端情况可降低JumpStart Taq抗体对Taq聚合酶的亲和力,从而降低有效性。
需要进行降落PCR。 “降落”PCR可显著提高许多PCR反应在各种应用中的特异性。降落PCR包括在初始PCR循环期间使用高于引物TM的退火/延伸温度。然后将退火/延伸温度降至引物TM进行剩余的PCR循环。可以在一个步骤中进行更改,也可以在几个周期内递减。
阴性对照出现PCR产物或“假阳性”结果。 试剂受到污染。 Sigma建议在每次进行PCR时使用不含DNA模板的空白试剂作为对照,以确定提取或PCR过程中使用的试剂是否被先前反应的模板污染。
孵育后组织未消化。 组织无需完全消化。 REDExtract-N-Amp组织PCR试剂盒并不需要完全消化组织。无需完全消化组织即可释放足够用于PCR的DNA。
口腔拭子吸收了所有溶液。 没有使用推荐的拭子类型。 DNA提取液的量较少,应使用泡沫拭子。避免使用纤维(如棉花或涤纶)拭子,因为溶液无法得到有效回收。



材料


     

  

参考文献

  1. Dieffenbach, C.W., and Dveksler, G.S. (Eds.), PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1995). Catalog Number Z701270
  2. Don, R.H. et al., ‘Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res., 19, 4008 (1991).
  3. Erlich, H.A. (Ed.), PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, New York (1989).
  4. Griffin, H.G., and Griffin, A.M. (Eds.), PCR Technology: Current Innovations, CRC Press, Boca Raton, FL (1994).
  5. Innis, M.A., et al., (Eds.), PCR Strategies, Academic Press, New York (1995).
  6. Innis, M., et al., (Eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, California (1990).
  7. McPherson, M.J. et al., (Eds.), PCR 2: A Practical Approach, IRL Press, New York (1995).
  8. Newton, C.R. (Ed.), PCR: Essential Data, John Wiley & Sons, New York (1995).
  9. Roux, K.H. Optimization and troubleshooting in PCR. PCR Methods Appl., 4, 5185-5194 (1995).
  10. Saiki, R., PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton, New York (1989).

 

购买须知:有限许可证

本产品的使用受到如下一项或多项美国专利及其对应的境外专利声明保护:US: 5,789,224和5,618,711。购买本产品,即相当于依照境外的专利声明获得了一份受限制、不可转让的使用许可,即将此等数量的产品用于购买者内部的研究用途。我们未明确表示、暗示或以禁止反言的形式授予您任何其他专利声明下的权利、进行任何专利方法申请的权利、进行任何形式的商业服务的权利,包括但不限于出于收费或其他商业考虑而报告购买者的研究活动结果的权利。本产品仅适合于研究用途。如需用于Roche专利许可的诊断用途,需另外征得Roche许可。有关购买许可的更多信息,可联系Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA获取。

    GenomePlex 为以下机构的注册商标: Rubicon Genomics, Inc.

JumpStart和JumpStart抗体根据美国专利号5,338,671和5,587,287以及其他国家的相应专利而获得许可。

Extract-N-Amp、GenElute、JumpStart和REDExtract-N-Amp是Sigma-Aldrich Co. LLC的商标。

JC,RC,PHC 01/13-1