动物组织DNA提取和WGA扩增实验方案

 引言

动物组织是遗传分析中常用的材料来源。以下实验方案是从动物样品中提取DNA的简单方法。一旦分离出DNA,就可以使用WGA1WGA2试剂盒通过全基因组扩增方法进行扩增。GenomePlex产品已用于扩增鸡、猪、牛、鱼和虾来源的基因组DNA。

建议使用GenElute哺乳动物基因组DNA Miniprep试剂盒(G1N10)进行此程序。

  1. 将20 mg组织放入微量离心管中。
  2. 消化组织:将组织沉淀重悬于180 μl裂解液T中。
  3. 加入20 μl蛋白酶K,涡旋混合。
  4. 在55°C下孵育2-4小时或过夜,直至组织完全溶解。在孵化过程中偶尔涡旋。
    任选的RNase处理:如果担心残留RNA,可加入20 μl RNase A溶液,在室温下孵育2分钟。
  5.  裂解细胞:涡旋15秒。向样品中加入200 μl裂解液。充分涡旋,因为混合物均匀对于有效裂解至关重要。70°C孵育10分钟。
  6. 准备柱:在每个预组装的GenElute MiniPrep结合柱中加入500 μl柱制备溶液,以12,000 × g离心1分钟。
  7. 准备结合:向裂解的样品中加入200 μl乙醇,然后涡旋混合。
  8.  加载裂解物:将样品试管的全部内容物转移到步骤5中处理过的结合柱中。以 ≥ 6500 × g离心1分钟。丢弃含有流通液的收集管,并将结合柱放入新的2 ml收集管中。
  9. 首次清洗:首次使用前,按照制备说明用乙醇稀释浓缩清洗液。向结合柱中加入500 μl清洗液,以 ≥ 6500 × g离心1分钟。丢弃含有流通液的收集管,并将结合柱放入新的2 ml收集管中。
  10. 第二次清洗:向结合柱中加入另外500 μl清洗液,并以最大速度(12,000-18,000 × g)离心3分钟,以干燥结合柱。在从柱上洗脱DNA之前,非常重要的一点是结合柱不得有乙醇。如果可见残留的乙醇,则将柱再离心一分钟。最后丢弃含有流通液的收集管,并将结合柱放入新的2 ml收集管中。
  11. 洗脱DNA:移取200 μl洗脱液直接到结合柱中心,在室温下孵育5分钟。以 ≥ 6500 × g离心1分钟以洗脱DNA。
  12.  将DNA样品保存在-20°C。
     

 WGA扩增

使用GenomePlex全基因组扩增试剂盒(WGA1)和/或完全全基因组扩增试剂盒(WGA2)进行GenomePlex全基因组扩增的实验方案。

断裂

  1. 从上述全血提取实验方案制备1 ng/ml的DNA溶液。
  2. 将1 μl 10X断裂缓冲液加入到PCR管中的10 μl DNA(1 ng /μl)中。
  3.  将试管置于95℃的热循环仪中刚好4分钟。
    注意:必须严格控制孵化时间,任何偏差都可能改变结果。 
  4. 立即将样品置于冰上冷却,并短暂离心。

文库的制备

  1.  加入2 μl 1x 文库制备缓冲液。 
  2. 加入1 μl文库稳定化溶液。
  3. 充分混合,置于95℃的热循环仪中2分钟。
  4. 将样品置于冰上冷却,并短暂离心。
  5. 加入1 μl文库制备酶,充分混匀,并短暂离心。
  6. 将样品置于热循环仪中,按如下所述孵育:
    16°C,20分钟
    24°C,20分钟
    37°C,20分钟
    75°C,5分钟
    保持4°C
  7. 从热循环仪中取出样品,并短暂离心。样品可立即扩增或在-20°C下储存最多三天。

扩增

  1. 将以下试剂加入到整个15 ml反应物中:
    7.5 μl 10x 扩增预混液
    47.5 μl无核酸酶水
    5.0 μl JumpStart Taq DNA聚合酶(12.5单位),用于WGA1
    或者
    5.0 μl WGA DNA聚合酶,用于WGA2
  2. 彻底混合,短暂离心,开始热循环:
    初始变性:95℃,3分钟
    执行以下14个循环:
    变性:95°C,15秒
    退火/延伸:65°C,5分钟
  3. 循环完成后,将反应物保持在4°C,或储存在-20°C,直到准备好进行分析或纯化。
     

 再扩增

  1. 将10 μl 1 ng/μl WGA扩增的DNA加入PCR管或多孔板中。
    注意:必须清除WGA反应物,以减少再扩增中可能存在的偏差。我们建议使用我们的GenElute™ PCR清理试剂盒(产品编号:NA1020)或分离单链和双链DNA的标准纯化方法。
  2. 制备扩增混合物。对于每个再扩增反应,将以下试剂添加到WGA扩增的DNA中(步骤1):
    47.5 μl无核酸酶水
    7.5 μl 10X 扩增预混液
    5 μl WGA DNA聚合酶
  3. 彻底涡旋,短暂离心,并开始热循环。以下配置已针对PE 9700或等效热循环仪进行了优化:
    初始变性:95°C,3分钟
    执行以下14个循环:
    变性:94°C,15秒
    退火/延伸:65°C,5分钟
  4.  循环完成后,将反应物保持在4°C,或储存在-20°C,直到准备好进行分析或纯化。WGA DNA的稳定性等同于在相同条件下储存的基因组DNA。
     

 纯化

使用GenElute PCR清理试剂盒(NA1020)进行扩增产物的纯化。

1.将GenElute Miniprep结合柱(带蓝色O形环)插入提供的收集管中(如果尚未组装)。向每个小量制备柱中加入0.5 ml柱制备溶液,并以12,000 × g离心30秒至1分钟。丢弃洗脱液。
注意:色谱柱准备液可最大限度地增加DNA与膜的结合,从而获得更稳定的得率。

2.将5倍体积的结合溶液加入到1倍体积的PCR反应物中,并混合。例如,向100 μl PCR反应物中加入500 μl结合溶液。将溶液转移到结合柱中。以最大速度(12,000至16,000 x g)离心色谱柱1分钟。丢弃洗脱液,但保留收集管。

3.将结合柱装回收集管中。将0.5 ml稀释的清洗液加入柱中,以最大速度离心1分钟。丢弃洗脱液,但保留收集管。
注意:在第一次使用之前,务必向浓缩清洗液添加乙醇。请参见制备说明。

4.将柱装回收集管中。以最大速度离心结合柱2分钟以便除去过量的乙醇,请勿额外添加任何清洗液。丢弃任何残留的洗脱液以及收集管。

5.将柱转移到新的2 ml收集管中。在每个柱的中心涂抹50 μl洗脱液或水。在室温下孵育1分钟。
注意:用水洗脱时,确保水的pH值在5.5至8.5之间。也可以使用用水稀释10倍的洗脱液进行洗脱。

6.为了洗脱DNA,以最大速度离心结合柱1分钟。PCR扩增产物现在存在于洗脱液中,可立即使用或在-20℃下储存。
 

 扩增产物的量化

使用全基因组扩增法扩增的DNA的量可以在纯化或不纯化的情况下检测。对于最高质量的DNA样品,强烈建议在扩增后纯化样品。可以使用Molecular Probes Inc.的PicoGreen® dsDNA定量测定(#P-7589)测量扩增产物。另一种检测扩增产物的方法是在NanoDrop® 分光光度计上进行分光光度吸收(OD260)。该仪器可在大动态范围(2-3700 ng)上测量1 μl样品的吸光度。
 

 应用数据

在各种动物组织上进行的全基因组扩增

我们的扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上可视化。每孔加载5 μl扩增产物。WGA扩增产物的平均大小为400 bp。如凝胶上所示,涂片图案因动物而异。使用WGA技术扩增的产物是特异性的,阴性对照中没有信号就说明了这点(泳道3)。

泳道1 - 1 kb标记物
泳道2 - 阳性对照
泳道3 - 阴性对照
泳道4 - 猪
泳道5 - 牛
泳道6 - 鸡
泳道7 - 鲶鱼
泳道8 - 虾

 材料