酶法测定半乳糖(半乳糖检测)

该检测方法适用于使用 半乳糖检测试剂盒 (MAK012) ,对细胞和组织培养的上清液、尿液、血浆、血清和其他生物样品中的半乳糖和乳糖进行比色/荧光检测。在该检测试剂盒中,半乳糖被半乳糖氧化酶氧化,产生比色(570nm)/荧光(λex= 535 nm /λem= 587 nm)产物,且产物量与所含的半乳糖成比例。对于荧光检测,该试剂盒具有0.2-1.0 nmol半乳糖的线性检测范围,对于比色检测,则为2-10nmol半乳糖检测范围。

 

注意事项和免责声明

本产品仅供研发使用,不得用于药物、家庭或其他用途。有关危险和安全处理方法的信息,请参阅安全数据说明书。

 

试剂

半乳糖检测缓冲液                                        25 mL

     货号MAK012A

半乳糖探针,溶于DMSO中                            0.2 mL

     货号MAK012B

半乳糖酶混合物                                           1 vl

     货号MAK012C

辣根过氧化物酶(HRP)                               1 vl

     货号MAK012D

半乳糖标准品,100 nmole /μL                       0.1 mL

     货号MAK012E

 

所需的自备试剂和设备

96孔平底板 - 建议使用带有透明底部的黑色平板(货号M5686或同类产品)进行荧光测定,使用透明板(货号 M4436或同类产品)进行比色测定。

荧光或分光光度计多孔板读数器

 

准备说明

半乳糖检测缓冲液 - 使用前将缓冲液放置于室温下。

半乳糖探针 – 即时可用。使用前将半乳糖探针放置至室温。避光-20°C条件下进行保存,并在2个月内使用。

对于荧光检测,在使用半乳糖探针前,用半乳糖检测缓冲液将等分试样的半乳糖探针溶液稀释5至10倍。这将减少荧光检测的背景信号。

半乳糖酶混合物和辣根过氧化物酶 – 分别将二者溶于220μL半乳糖检测缓冲液中。用移液枪充分混合后,分别分装在-20°C避光条件下保存。在溶解后2个月内使用完,并在使用时保持冷藏。

 

储存/稳定性

该试剂盒保存于湿冰上进行运输。建议在-20°C避光条件下储存。

所有样品和标准品应设置重复实验。

 

用于比色检测的半乳糖标准品

用990μL半乳糖检测缓冲液稀释10μL的100 mM(100 nmole /μL)半乳糖标准溶液以制备1 mM(1 nmole /μL)的标准溶液。充分混合后,加入0、2、4、6、8和10μL的1 mM半乳糖标准溶液至96孔板中,从而设置0(检测空白)、2、4、6、8和10 nmole /孔的标准溶液。向每个孔中加入半乳糖检测缓冲液,使终体积达到50μL。

 

用于荧光检测的半乳糖标准品

对于比色测定,准备1 mM半乳糖标准溶液。 用180μL半乳糖检测缓冲液稀释20μL的1 mM标准溶液,以制备0.1 mM(0.1nmole /μL)标准溶液。将0、2、4、6、8和10μL的0.1 mM半乳糖标准溶液加入至96孔板中,从而设置0(检测空白)、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 nmole /孔的标准溶液。向每个孔中加入半乳糖检测缓冲液,使终体积达到50μL。

 

样品制备  液体样品可以直接进行测定。加入半乳糖检测缓冲液将使样品终体积达到50μL。

对于未知样品,建议测试几个样品的稀释液,以确保读数在标准曲线的线性范围内。

 

检测反应

1.根据表1中的方案配置主反应混合物。每个反应(孔)需要50μL主反应混合物。

表1

反应混合物

试剂

体积

半乳糖检测缓冲液

44 μL

半乳糖探针

2 μL

半乳糖酶混合物

2 μL

HRP

2 μL

 

2. 向每个孔中加入50μL主反应混合物。使用水平振荡器或通过移液枪充分混合,并在37℃下孵育反应60分钟。在孵育期间需保证避光。

3. 对于比色测定,测定570 nm处的吸光度(A570)。对于荧光测定,测定荧光强度(λex= 535 /λem= 590nm)。

 

结果

计算

设置半乳糖标准品中空白组所对应的值为背景值。通过从所有读数中减去空白组吸光值来校正背景。背景值十分重要,必须从所有读数中减去。使用相应的半乳糖标准品的吸光值绘制标准曲线。

注意:每次进行检测时都必须设置新的标准曲线。

半乳糖浓度

Sa/Sv = C


Sa =根据标准曲线计算所得未知样品(nmole)中的半乳糖量

Sv =加入孔中的样品体积(μL)

C =样品中半乳糖的浓度

 

计算举例

半乳糖的量(Sa)= 5.84 nmole

(从标准曲线中获得)

样品体积(Sv)=50μL

半乳糖的分子量= 180.16

样品中半乳糖浓度

5.84 nmole/50 μL = 0.1168 nmole/μL

0.1168 nmole/μL x 180.16 ng/nmole = 21.04 ng/μL

MAK012-Standard-Curve

材料