用于直接检测型Southern或Western Blotting的明胶封闭缓冲液

货号 No. G7663

 

产品描述

为了特异性地检测固定在固体支持物上的抗原或靶分子,必须将支持物上未被占据的结合位点进行封闭以防止探针和检测分子结合。否则,核酸探针、抗体和检测酶将在膜上或与靶分子上发生随机结合。对这些位点进行封闭是最小化背景噪音的一种方式。

对于非特异性蛋白结合位点的封闭可以通过各种蛋白质和清洗剂溶液完成;但是,封闭溶液必须与检测系统兼容。明胶封闭缓冲液与各种检测系统兼容,包括生物素、荧光素和DIG检测系统。靶分子可以固定在硝酸纤维素、尼龙和电荷改性的尼龙膜上。明胶封闭缓冲液不适合于PVDF膜的封闭。

 

试剂

明胶封闭缓冲液以干粉形式提供,可经复溶用于1升封闭缓冲液的制备

 

未提供的所需试剂

在适当时提供Sigma货号

  • 含有0.05% (v/v) Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)(PBS-T),货号P3563
  • 蛋白探针或抗体
  • 0.1 M Tris, 0.1M NaCl, pH 9.5 (用于Southern blotting)

 

制备指南

将一份明胶封闭缓冲液包装中的内容物溶解在800ml去离子水中。一旦内容物溶解,添加去离子水至1000ml并搅拌混合。

 

储存/稳定性

在室温下储存粉末。复溶后,将明胶封闭缓冲液储存在2-8°C,以避免细菌污染。复溶后溶液可在2-8°C保存一周。

 

操作步骤

A.   用于Southern blot封闭、结合及检测的推荐操作步骤

       注意:在敏感体系下,指纹将会出现在膜上。务必始终使用无粉手套。避免使用带嵴的钳子,因为接触点也可能会出现。

1.     将标记的核酸转移到硝酸纤维素上或交联到尼龙或带正电的尼龙膜上后,将膜与明胶封闭缓冲液在环境温度下孵育60分钟(0.6 ml/cm2)或在37°C下孵育30分钟并轻轻摇动。 另外,请注意封闭液可在2-8°C过夜完成。

注意:如果将使用标记的核酸探针用于检测未标记的核酸靶标,则必须首先采用合适的单链DNA封闭膜根据相应的操作步骤完成封闭。

2.     现在则可以用蛋白偶联物或针对核酸上标记的特异性抗体与膜发生结合。
蛋白偶联物或抗体应采用含有0.05% (v/v) Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS-T)进行稀释。当采用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(货号S2890) 或 链亲和素-过氧化物酶(货号S5512)作为蛋白偶联物时,建议采用1-10 ng/ml的起始浓度。

3.     将膜与蛋白质结合物或抗体溶液(0.6 ml/cm2)在环境温度下孵育30-60分钟,同时轻轻摇动。

4.     采用PBS-T进行五分钟洗膜并轻轻摇动,重复三到五次。

5.     如果蛋白质偶联物利用碱性磷酸酶作为酶,则必须用PBS-T洗涤三次,每次用0.1M Tris、0.1M NaCl、pH9.5的洗涤液洗涤三分钟。Tris洗涤可去除任何残留的磷酸盐并将膜平衡至碱性pH以测定碱性磷酸酶。如果蛋白质偶联物利用辣根过氧化物酶作为酶,则在PBS-T洗涤后可直接将膜暴露于底物。

6.     现在可以按照生产产商的说明将膜暴露于发色或化学发光底物。

B.   用于Westhern blot封闭、结合及检测的推荐操作步骤

1.     将目标蛋白转移到硝酸纤维素上或尼龙膜上后,将膜与明胶封闭缓冲液在环境温度下孵育60分钟(0.6 ml/cm2)或在37°C下孵育30分钟并轻轻摇动。 另外,请注意封闭液可在2-8°C过夜完成。

2.     采用明胶封闭缓冲液对一抗进行稀释。常用的一抗稀释比例为1:1000,不同情况可能会有所不同,从1:100至1:100,000或更高。研究人员必需确定最佳的稀释比例。

3.     将膜与一抗(0.6 ml/cm2)在2-8 °C孵育1-16小时并轻轻摇动

4.     采用PBS-T进行五分钟洗膜并轻轻摇动,重复三到五次。

5.     采用明胶封闭缓冲液对二抗-酶偶联物进行稀释,并与膜孵育30-120分钟。孵育结束后,采用PBS-T进行五分钟洗膜并轻轻摇动,重复五到六次。

6.     现可根据生产商的说明将膜暴露于发色或化学发光底物。

C.   用于标记核酸比色检测的建议

1.     应将膜暴露于比色底物直至看到阳性信号,但在背景也开始产生信号应停止反应。膜应暴露于底物不超过60分钟。

2.     对于比色过氧化物酶底物,可以通过除去底物并将膜转移到含有1%SDS的PBS或TBS(Tris缓冲盐水)中的0.1%叠氮化钠溶液来终止反应。

3.     对于碱性磷酸酶底物,可通过去除底物并将膜转移至0.3M磷酸钠溶液(pH 5.5)来终止反应。

D.   用于标记核酸化学发光检测的建议

1.     在暴露于底物后,应将多余的底物吸干并将膜转移至固体支持物上。建议将膜转移到比其稍大的“页面保护膜”上。然后将支撑的膜放在可热密封的袋子中。使用温和的压力,通过在被装入的膜上滚动玻璃试管或移液管使膜和塑料袋之间的气泡被挤出。将袋子进行密封并把袋子外面多余的底物擦去。将被装入的膜放入胶片盒中并曝光在胶片上。

2.     最开始应使用1分钟的曝光,但是如果没有看到信号,则将膜曝光更长时间。如果看到过多信号,请尽可能使用短曝光。更多其他建议,请参阅故障排除指南

E.   用于固定蛋白Western blot检测的建议

1.     酶-抗体偶联物的稀释比例取决于用于后续检测的底物,并且应由研究人员进行优化。稀释的一般指导原则是1:5000的显色底物和1:50,000的化学发光底物。稀释比基于~1mg/ml酶-抗体偶联物的初始浓度。

2.     为了验证二抗的质量,可通过略去一抗进行“空白”膜设置。如果在没有一抗时仍存在背景,则需要使用不同的封闭试剂或进一步稀释偶联物。

3.     通常可通过将膜浸入含有100mM甘氨酸(pH 2.3)的缓冲液中搅拌30分钟来去除用于检测抗原的抗体。这并不是一个普遍适用的方法;一些抗原会从膜上解离,因此随后的结合检测将会是微弱的或不存在的。

           许多研究人员在可能的情况下倾向于平行制备膜,因而可以避免在“剥离”步骤中的不确定性。

 

故障排除指南


无信号



无靶标存在
如果膜上不存在标记的核酸,则不能被检测到。 在下一次检测中可加入阳性对照。
无靶标蛋白存在
通过在膜上使用Ponceau S溶液(货号P7170)对蛋白质进行可视化以验证转膜操作步骤。如果可能,应始终设置阳性对照以确保各种组分或操作步骤在正常发挥作用。
过度封闭 如果使用了过高的封闭试剂浓度,则可能会发生信号掩蔽。可以进行1:1至1:3的稀释以降低浓度。如果问题仍然存在,应尝试使用其他封闭试剂
采用化学发光系统时曝光时间不够
首次曝光应为1分钟。如果没有看到信号,则应延长曝光时间。Sigma建议尝试5分钟、10分钟等。如果看到过多信号,请尝试尽可能短的曝光(低至1秒)并不使用暗匣。
酶偶联物可能已失去酶活
确定酶偶联物是否具有活性。
高背景 过多的抗体或蛋白偶联物
采用梯度的抗体或蛋白偶联物直至获得可接受的信噪比。
不合适的封闭试剂
可采用推荐体积一半的水量进行试剂制备,增加封闭试剂的浓度。此外,一些抗体可能与某些封闭试剂产生交叉反应。为了测试这种可能性,可准备一个不含一抗的“空白”膜。
不合适的封闭方法
增加封闭的时间并提高封闭温度至37 °C。
不合适的洗涤方法 增加洗涤的次数。
在比色底物溶液中过度孵育
减少染色时间。应将膜暴露于比色底物直至看到阳性信号,但在背景信号开始产生时应停止反应
对于比色底物:孵育5-10分钟或至任何条带可见时。所需时间可以增加或减少,但不应超过60分钟。
为终止反应:对于碱性磷酸酶底物,采用0.3 M磷酸钠(pH 5.5)溶液
对于辣根过氧化物酶底物,用含有1%SDS的0.1%叠氮化钠在TBS(Tris缓冲盐水)或PBS(磷酸盐缓冲盐水)中洗涤膜
不适当的胶片 切换到指定用于化学发光检测的胶片,例如Kodak Biomax Light,MS和MR。
无关的点 聚集的蛋白或抗体偶联物 通过0.2微米醋酸纤维素滤器过滤偶联物或10,000×g离心偶联物溶液10分钟并使用上清液。

 

材料

     

 

参考文献

      For Southern blotting:

  1. Sambrook, J. F., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, p. 9.47-9.50, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

      For Western blotting:

  1. Bjerrum, O. J. and Heegaard. N. H. H. CRC Handbook of Immunoblotting of Proteins, Vol. I, Technical Descriptions, p. 229-236, (CRC Press, 1988).
  2. Dunbar, B. S. (ed.) Protein Blotting: A Practical Approach, p. 67-70, (IRL Press, NY, 1994).
  3. Fortin, A., et al., A 56- to 54-kilodalton non grata signal in immunoblot analysis using the horseradish peroxidase chemiluminescence system. Biochem. Cell Biol., 72, 239-43 (1994).