GenElute™细菌基因组DNA试剂盒实验方案l (NA2100, NA2110, NA2120)

 产品描述

我们的GenElute™细菌基因组DNA试剂盒提供了一种从各种培养细菌中分离纯DNA的简便方法。该试剂盒包含从革兰氏阴性细菌中分离和纯化基因组DNA所需的所有试剂。对于大多数革兰氏阳性细菌,该试剂盒必须与选购的溶菌酶(L4919)一起使用,以有效裂解厚的肽聚糖细胞壁。为了方便制备溶菌酶原液,我们提供了一种稀释的革兰氏阳性裂解溶液。

GenElute试剂盒将硅胶膜系统的优势与微量离心形式结合在一起,同时无需采用昂贵的树脂、乙醇沉淀、以及诸如苯酚和氯仿等有害有机化合物。细菌首先在含有高离液盐的溶液中裂解,以确保大分子彻底变性。之后加入乙醇,当裂解物在微量离心管中离心到硅胶膜上时,DNA结合到膜上。在洗涤去除污染物后,将DNA在200 μL的Tris-EDTA溶液中洗脱。

预期的基因组DNA得率取决于细菌培养物的细胞密度、细菌种属以及所用的菌株。附录2列出了从一些革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中纯化的基因组DNA的典型得率。通过GenElute试剂盒纯化所得的DNA的A260/A280比率介于1.6-1.9之间,最大长度可达50 kb。所得DNA可以用于各类下游应用,包括限制性核酸内切酶消化、PCR和南方印迹。
 

提供的试剂 货号 NA2100 
10次
NA2110 
70次
NA2120 
350次
革兰氏阳性裂解液 L7539 3 mL 20 mL 90 mL
裂解液T B6678 2.5 mL 20 mL 90 mL
裂解液C B8803 2.5 mL 20 mL 90 mL
清洗液1 W0263 7 mL 50 mL 225 mL
浓缩清洗液 B6553 2.5 mL 20 mL 90 mL
洗脱液(10 mM Tris-HCl,0.5 mM EDTA,pH9.0) B6803 5 mL 35 mL 180 mL
柱准备液 C2112 7 mL 60 mL 225 mL
蛋白酶K P2308 1 x 5 mg 3 x 10 mg 2 x 100 mg
RNase A溶液 R6148 0.25 mL 1.7 mL 8 mL
管中的GenElute核酸结合柱 C9471 每个10 每个70 每个5 x 70
收集管,容量2.0 mL T5449 或 T7813 每个3 x 10 每个3 x 70 每个15 x 70

需要但未提供的仪器和试剂

  • 37°C水浴或加热块
  • 55°C水浴或加热块
  • 移液器吸头(建议使用气溶胶阻隔)
  • 1.5 mL微量离心管,用于裂解
  • 微量离心机(2 mL管,装有转子)*
  • 乙醇(95%-100%),货号:E7023E7148459836
  • 分子生物学试剂水,货号:W4502
  • 溶菌酶,货号:L4919(仅用于革兰氏阳性)
  • 变溶菌素,货号:M9901(仅用于链球菌)
  • 溶葡球菌酶,货号:L7386(仅用于葡萄球菌)

注意:为了容纳所有的管,建议使用24位转子。如果您使用的是36位转子,我们建议每隔一个位置放一个管。
 

 储存和稳定性

室温保存试剂盒。如果试剂盒的任何试剂发生沉淀,只需加热至55-65°C,直至沉淀物溶解,但使用前需冷却至室温。
 

 制备说明

1. 将水浴或加热块预热至55°C
适用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。 

2. 将水浴或加热块预热至37°C
仅适用于革兰氏阳性菌。
 

3. 彻底混合试剂
检查试剂是否有沉淀。如果试剂盒的任何试剂发生沉淀,加热至55-65°C,直至沉淀物溶解,然后在使用前冷却至室温。
 

4. 稀释浓缩清洗液
用10 mL(供10次使用的包装)、80 mL(供70次使用的包装)或360 mL(供350次使用的包装)95-100%乙醇稀释浓缩液。每次使用后,盖紧稀释的清洗液,以防乙醇蒸发。
 

重构蛋白酶K
根据表1,将一瓶蛋白酶K干粉溶于水,得到20 mg/mL原液。蛋白酶K溶液可在2-8℃下保存数天。如要长期保存,则将未使用的溶液等分并储存于-20℃下以备后用。所提供的原样产品在室温下稳定。

注意:每次必须将蛋白酶K溶液直接添加到每个样品中。请勿将蛋白酶K溶液与裂解液混合保存。
 

表1. 蛋白酶K溶液的制备
 

货号 蛋白酶K
NA2100 5 mg 0.25 mL
NA2110 10 mg 0.5 mL
NA2120 100 mg 5.0 mL

1. 制备溶菌酶溶液仅适用于革兰氏阳性菌
使用所包含的革兰氏阳性裂解液(L7539)作为稀释剂,制备2.115 × 106单位/mL溶菌酶(L4919)原液(约45 mg/mL)。例如,如要制备1 mL溶菌酶溶液,将2.115 × 106单位的溶菌酶溶解在1 mL革兰氏阳性裂解液中。

上下吸移混合物或涡旋,以溶解溶菌酶(参见下面的注释)。对于要进行的每种DNA制备,需要200 μL溶菌酶溶液。需要多制备一些溶液,以弥补移液错误。溶菌酶溶液应在制备后当天用完。

注意:与涡旋相比,通过上下吸移混合物更容易使溶菌酶溶解。过度涡旋容易起泡。这可造成溶菌酶不易溶解,在这种情况下,不需要在使用前使其完全溶解。基因组DNA得率不会受影响,因为溶菌酶在37°C下孵育期间会溶解。
 

 操作步骤

如果下游应用要求基因组DNA的剪切尽量低,例如最终产物用于长时扩增PCR,则在随后的操作中通过轻轻移液或倒置进行混合均匀,而不是通过涡旋混合。附录1列出了g-力至RPM的转换。

A. 革兰氏阴性细菌的制备

1a. 收获细胞
12,000-16,000 × g离心2分钟,以沉淀1.5 mL过夜细菌肉汤培养物。完全取出培养基并丢弃。
注意:如果细菌在富含营养的培养基如极品肉汤(T9179)中繁殖,则须将起始材料的体积减少至0.5 mL过夜细菌肉汤培养物,以免使GenElute柱过载。有关更多信息,请参见附录2。

2a. 重悬细胞
将沉淀重悬于180 μL裂解液T或者GenElute哺乳动物基因组DNA试剂盒(B6678)的缓冲液STL中。如果不担心残留RNA,则直接前往执行步骤3a。
可选的RNase A处理:如果需要无RNA的基因组DNA,则加入20 μL RNase A溶液(R6148),混合,在室温下孵育2分钟,然后前往执行步骤3a。

3a. 准备裂解细胞
向样品中加入20 μL蛋白酶K溶液。混合并在55℃下孵育30分钟。

4a. 裂解细胞
加入200 μL裂解液C(B8803),彻底涡旋(约15秒),并在55℃下孵育10分钟。
为了有效裂解,必须混合均匀。
执行第5步。

B. 革兰氏阳性细菌的制备

1b. 使用鸡蛋白溶菌酶(L4919)制备溶菌酶溶液
按照制备说明,制备2.11 5× 106单位/mL溶菌酶原液。对于要进行的每种DNA制备,需要200 μL溶菌酶溶液。需要多制备一些溶液,以弥补移液错误。
注意:
如果用的是葡萄球菌,则用200单位/mL溶葡球菌酶(L7386)补充溶菌酶溶液。对于链球菌,则用250单位/mL变溶菌素(M9901)补充溶菌酶溶液。

2b. 收获细胞
12,000-16,000 × g离心2分钟,以沉淀1.5 mL过夜细菌肉汤培养物。完全取出培养基并丢弃。
注意:如果细菌在富含营养的培养基如极品肉汤(T9179)中繁殖,则须将起始材料的体积减少至0.5 mL过夜细菌肉汤培养物,以免使GenElute柱过载。有关更多信息,请参见附录2。

3b. 重悬细胞
将沉淀重悬于200 μL溶菌酶溶液(步骤1b中制备)中,并在37℃下孵育30分钟。
可选的RNase A处理:如果不担心残留RNA,则直接前往执行步骤4b。
如果需要无RNA的基因组DNA,则加入20 μL RNase A溶液,在室温下孵育2分钟,然后前往执行步骤4b。

4b. 裂解细胞
向样品中加入20 μL蛋白酶K溶液,然后加入200 μL裂解液C(B8803)。彻底涡旋(约15秒),并在55℃下孵育10分钟。为了有效裂解,必须混合均匀。前往执行第5步。

从革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中分离DNA
这是在步骤1-4a和/或步骤1-4b中制备了裂解物之后的后续操作。

5. 准备色谱柱
在每个预组装的GenElute Miniprep结合柱(带有红色O形环,不要与其他GenElute试剂盒混淆)中加入500 μL柱准备液,置于2 mL收集管中。12,000 × g离心1分钟。丢弃洗脱液。
注意:色谱柱准备液可最大限度地增加DNA与膜的结合,从而获得更稳定的得率。

6. 准备结合
向裂解物中加入200 μL乙醇(95-100%),并涡旋5-10秒充分混合。确保混合均匀。

7. 加载裂解物
将管中的全部内容物转移到结合柱中。在将内容物转移到色谱柱中时,使用广口移液器吸头,以减少对DNA的剪切。≥ 6500 × g离心1分钟。丢弃含有洗脱液的收集管,并将柱置于新的2 mL收集管中。

8. 第一次清洗
向柱中加入500 μL清洗液1(W0263),以 ≥ 6500 × g离心1分钟。丢弃含有洗脱液的收集管,并将柱置于新的2 mL收集管中。

9. 第二次清洗(重要提示:确认已向浓缩清洗液瓶中添加乙醇。
向柱中加入500 μL清洗液,以最大速度(12,000-16,000 × g)离心3分钟以干燥柱。在洗脱DNA之前,柱中不得含有乙醇。
如果看到有乙醇残留,则以最大速度将柱额外离心1分钟。执行此额外的离心步骤后,收集管可被清空和再用。最后,丢弃含有洗脱液的收集管,并将柱置于新的2 mL收集管中。

10. 洗脱DNA
移取200 μL洗脱液(B6803)直接到柱中心,以 ≥ 6500 × g离心1分钟以洗脱DNA。为了提高洗脱效率,在加入洗脱液后在室温下孵育5分钟,然后离心。
可选操作:重复步骤10进行第二次洗脱:用另外的200 μL洗脱液,洗脱到新的2 mL收集管,或洗脱到第一洗脱所使用的2 mL收集管中。通过进行第二次洗脱,得率可提高20-50%。

洗脱液含有纯基因组DNA。DNA可短期储存于2-8°C下。
如要长期保存,建议储存于-20°C下。避免冻融,这会导致DNA链断裂。洗脱液有助于在这些温度下稳定DNA。
 

用GenElute™细菌gDNA试剂盒分离的细菌gDNA的PFGE。 图1. 用GenElute™细菌gDNA试剂盒分离的细菌gDNA的PFGE。

使用GenElute™细菌基因组DNA试剂盒从各种细菌中分离纯化的基因组DNA。使用BioRad CHEF DRII系统,将来自各个细菌样品的1 μg等分DNA试样,在0.5 X TBE中的1%琼脂糖凝胶上,在150伏下分离16小时。初始脉冲时间为2秒,最终脉冲时间为13秒,起始比率为1.0,泵速设定为70,PFGE在4℃下进行。M代表0.1-200 kb脉冲标记(货号:D2291)。

泳道

1. 大肠杆菌

2.荧光假单胞菌

3. 枯草芽孢杆菌

 

基因组DNA的浓度和质量可通过分光光度分析和琼脂糖凝胶电泳确定。在TE缓冲液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH 8.0-8.5)中稀释DNA,使用石英微量比色皿测量260 nm、280 nm和320 nm处的吸光度。260 nm和280 nm处的吸光度应介于0.1与1.0之间(或在分光光度计的线性范围内)。320 nm吸光度用于校正背景吸光度。260 nm处的吸光度1.0对应于约50 μg/mL双链DNA。A260 - A320 / A280 - A320之比应为1.6-1.9。
DNA的大小和质量可通过琼脂糖凝胶电泳确定1。在0.5 X TBE缓冲液(T6400)中含有0.8%琼脂糖(A9539)的凝胶可很好地分离基因组DNA。溴化乙锭(E1510)之类的嵌入染料可用来观察DNA,并对比已知的DNA标记物,例如λ-DNA Hind Ⅲ消化物(D9780),进行测量。基因组DNA应作为单一的大分子量条带迁移,几乎没有剪切迹象。确定DNA大小的一个更精确的方法是用脉冲场凝胶电泳2

 故障排除

 

问题 原因 解决方案
溶菌酶难以溶解。 溶液混合不充分。 通过上下移液来溶解溶菌酶,而不是通过涡旋的方式。过度涡旋将导致起泡,从而降低溶菌酶的溶解度。溶菌酶可能不易溶解。使用前它不需要完全溶解,因为它在37℃孵育期间会溶解。
结合柱堵塞。 样品太大。 以后用较少的细胞(≥ 1 × 1010细胞/mL)。为了不浪费当前的样品,可增加g力和 / 或离心更长时间,直到裂解物全部通过结合柱。基因组DNA得率可能会降低。
在加载到柱上之前,裂解物看起来严重胶凝。 样品太大。 以后用较少的细胞(≥ 1 × 1010细胞/mL)。延长孵育时间和 / 或增加蛋白酶K溶液(步骤3a)或溶菌酶溶液(步骤3b)的量,这取决于执行的是革兰氏阴性还是革兰氏阳性程序。例如,加倍孵育时间和酶的量。
基因组DNA得率低。 样品太老。 不同菌种和菌株的得率会有所不同。可能有必要在细菌培养达到最大密度之前或在它们完全汇合时使用细菌培养物。
细胞裂解不充分。 延长孵育时间和 / 或增加蛋白酶K溶液(步骤A3)或溶菌酶溶液(步骤B3)的量,这取决于执行的是革兰氏阴性还是革兰氏阳性程序。例如,加倍孵育时间和酶的量。
裂解物 / 乙醇混合不均匀。 为确保混合均匀,在加载到结合柱之前涡旋5-10秒。如果下游应用要求基因组DNA的剪切尽量低,例如最终产物用于长时扩增PCR,则通过轻轻移液或倒置进行混合均匀,而不是通过涡旋混合。
DNA洗脱不完全。 确认DNA在200 μL洗脱液中洗脱。在将洗脱液加入柱中后,在室温下孵育5分钟,可以改善DNA得率。可以用200 μL洗脱溶液进行第二次和第三次洗脱。
在结合期间没用乙醇。 检查确认在步骤7中将样品加载到结合柱之前,在步骤6中添加了乙醇。
洗脱液含有来自清洗步骤的残留乙醇。 在洗脱DNA之前,必须清除最终清洗步骤残留的乙醇。离心更长时间或离心两次,以使膜干燥。如果含有乙醇的洗脱液与结合柱接触,则在洗脱DNA之前重复离心步骤。
浓缩清洗液在使用前未加稀释。 使用前检查确认浓缩清洗液已用乙醇适当稀释。
用水代替了洗脱液进行洗脱。 建议使用洗脱液以获得纯化DNA的最佳得率及储存效果。如果用水洗脱DNA,确认pH值至少为7.0,以避免在长期储存时可能使DNA发生酸水解的酸性条件。
DNA的纯度低于预期;A260 / A280比率太低。 样品是用水稀释的。 用洗脱液(10 mM Tris-HCl,0.5 mM EDTA,pH9.0)或10 mM Tris-HCl,pH8.0-8.5作为洗脱液。
二氧化硅微粒造成背景读数高。 以最大速度离心DNA样品1分钟;用上清液重复读取吸光度读数。
DNA的纯度低于预期;A260 / A280比率太高。 基因组DNA被RNA污染。 在以后的分离中包括RNase A处理步骤或用RNase A溶液处理最终产物,并重新纯化。可能有必要延长步骤A2和B3中的RNase A孵育时间,以完全消化残留的RNA。
DNA被剪切。 基因组DNA处理不当。 该试剂盒的设计旨在省去DNA沉淀和再悬浮操作,这是其他基因组DNA试剂盒中的常规步骤,这些步骤可造成DNA剪切。所有移液步骤都应尽可能温和地进行。建议使用广口移液器吸头以帮助消除剪切问题。如果下游应用要求基因组DNA的剪切尽量低,例如最终产物用于长时扩增PCR,则通过轻轻移液或倒置进行混合均匀,而不是通过涡旋混合。
细胞太老。 当暴露于细胞壁裂解酶时,生长时间太长的培养物可能会过早溶解,导致内源核酸酶的释放,从而造成DNA降解。用新鲜的培养物开始操作。
下游应用程序被抑制。
最终的基因组DNA制备物中携带有乙醇。 在最后一次清洗结合柱(步骤9)后,不要让洗脱液与柱接触。如有必要,在清空收集管后,再以最大速度(12,000-16,000 × g)离心色谱柱1分钟。
最终的基因组DNA制备物中携带有盐。 在步骤8和9中添加清洗液之前,确保将结合柱转移到新的2 mL收集管中。

 参考文献

1. Sambrook, J. F., and Russell, D., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 2001).

2.Birren, B., and Lai, E., Pulsed Field Gel Electrophoresis: A Practical Guide (Academic Press, San Diego, CA, 1993).
 

 附录1

注意:所有离心速度均以g为单位给出。有关将g-力转换为RPM的信息,请参阅表2。如果没有所需g力的离心机 / 转子,请尽可能使用最大g力,并按比例增加离心时间。离心直至所有液体通过色谱柱。

表2. 常用转子的离心力(以g为单位)转换为RPM的转换表
 

离心机 转子
(max)
半径
(cm)
6,500 x g
时的rpm
12,000 x g
时的rpm
16,000 x g
时的rpm
Eppendorf
5410

-

12

5.8

10,012

13,555

15,652
5415C F45-18-11 18 7.3 8,924 12,124 14,000
5415D&R F45-24-11 24 8.3 8,369 11,392 13,155
5417C,D,&R F45-30-11 30 9.5 7,823 10,634 12,279

有关所选常用离心机和转子的转速(RPM),请参见上表。可以使用以下公式计算未列出的转子的正确RPM:

式中:RCF = 所需的重力加速度(相对离心力),单位为g;
r = 转子半径,单位为cm;
RPM = 达到所需g力所需的每分钟转数
 

 附录2

表3. 使用GenElute细菌基因组DNA试剂盒的典型DNA得率
 

来源 培养基类型 过夜培养物的量 每mL过夜培养物的OD600 * 典型的DNA得率(用RNase处理过)**
大肠杆菌,ATCC# 11775 极品肉汤(T9179 0.8 mL 12.5 20 μg
大肠杆菌,ATCC# 11775 极品肉汤(L7658 1.5 mL 5 20 μg
大肠杆菌,DH10B 极品肉汤(L7658 1.0 mL 5 15 μg
荧光假单胞菌ATCC# 13525 极品肉汤(T9179 0.8 mL 16 25 μg
荧光假单胞菌ATCC# 13525 极品肉汤(N7519 1.5 mL 2 20 μg
枯草芽孢杆菌,ATCC# 6051 极品肉汤(T1438 1.5 mL 6 25 μg
变异链球菌ATCC# 35668 极品肉汤(T1438 1.5 mL 1.3 15 μg***
变异链球菌,ATCC# 14990 极品肉汤(N7519 1.5 mL 2 8 μg****
* 数值已根据稀释因子进行了调整。所有读数均使用Varian Cary® 100分光光度计获得。
** 基于进行了两次200 μL洗脱。
***溶菌酶溶液补充有250单位/mL的变溶菌素(M9901)。
****溶菌酶溶液补充有200单位/mL的溶葡球菌酶(L7386)。

 

 材料