GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 微量提取试剂盒方案 ( G1N10, G1N70 , GN1350 )


 产品描述

GenElute™哺乳动物基因组 DNA 微量提取试剂盒提供了一种从多种培养细胞、组织(包括啮齿动物尾巴)和新鲜全血或白细胞中分离纯基因组 DNA 的简单方便的方法。该试剂盒结合了硅结合微旋格式的优点,且无需用到昂贵的树脂、乙醇沉淀、以及苯酚、氯仿等有害有机化合物。起始原料在含有离液盐的溶液中裂解,以确保大分子彻底变性。当裂解物在微量离心管中通过二氧化硅膜离心时,乙醇的加入会导致DNA结合。洗涤去除污染物后,DNA 在 200 μL Tris-EDTA 溶液中洗脱。

基因组 DNA 的预期产量将根据所用起始原料的数量和类型而有所不同(例如,在不到一小时的时间内,可从 2 x 106  HeLa 细胞中分离出 15-25µg 经核糖核酸酶 A 处理的 DNA)。经试剂盒纯化的 DNA 的 A260/A280  比值在 1.6 和 1.9 之间,长度可达 50 kb。该 DNA 可用于限制性内切酶消化、PCR、Southern 印迹杂交和测序反应等下游应用
 

  目录 G1N10 G1N70 G1N350
提供的试剂 编号 10 份制剂 70 份制剂 350 份制剂
重悬溶液 P3980 3 mL 20 mL 100 mL
裂解液 T B6678 2.5 mL 20 mL 90 mL
裂解液 C B8803 2.5 mL 20 mL 90 mL
柱制备液 C2112 7 mL 60 mL 225 mL
洗涤浓缩液 B6553 2.5 mL 20 mL 90 mL
洗脱液 (10 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 9.0) B6803 5 mL 35 mL 180 mL
蛋白酶K P2308 1 × 5 mg 3 × 10 mg 2 × 100 mg
核糖核酸酶 A 溶液 R6148 0.25 mL 1.7 mL 8 mL
管中的 GenElute™微量提取吸附柱 C9471 各 10 各 70 各 5 × 70
采集管,2.0 mL 容量 T5449 或 T7813 各 4 × 10 各 4 × 70 各 20 × 70


 需要但未提供的试剂和设备

  • 55℃ 水浴或恒温水浴摇床
  • 70℃ 水浴或微量恒温仪
  • 带气溶胶屏障的移液器吸头(推荐)
  • 用于裂解的1.5 mL 微量离心管
  • 微量离心机(2 mL 管,装有转子)*
  • 乙醇 (95–100%),目录号  E7148E7023, 或 459836
  • 分子生物试剂水,目录号 W4502
    *注意:为了确保所有试剂管的正确放置,建议使用 24 位转子。如果您使用的是
    36 位转子,我们建议您每隔一个位置妥善放置试剂管


 贮存和稳定性

>试剂盒室温贮存。如果任何试剂盒试剂形成沉淀物,请以 55–65°C 温热,直到沉淀物溶解,并在使用前冷却至室温。


 制备说明

在开始该程序之前,执行以下操作:

  1. 将水浴或水浴摇床预热至 55°C
    以使用组织、啮齿动物尾巴、新鲜全血和白细胞。
  2. 将水浴或微量恒温仪预热至 70°C
    以使用培养细胞和组织。
  3. 彻底混匀试剂
    检查试剂沉淀。如有任何试剂形成沉淀,请以 55–65°C 温热,直至沉淀溶解,并在使用前冷却至室温。
  4. 稀释洗液浓缩液
    用 10 mL(10 份制备包)、80 mL(70 份制备包)或 360 mL(350 份制备包) 95-100% 乙醇稀释浓缩液。每次使用后,将稀释的洗涤液盖紧,以防乙醇蒸发。
  5. 将蛋白酶 K 溶解于水中
    根据下表 1,将一瓶蛋白酶 K 粉末溶解于水中(目录号 W4502)以获得 20 mg/mL 的储备溶液。此溶液可在 2–8°C 条件下保存数天。若要保存更长时间,溶液中未使用的部分可在 –20°C 条件下等分保存至需要之时。本品在室温下稳定。
    每次样品制备时必须直接加入蛋白酶 K 溶液。切勿将蛋白酶 K 和裂解液合并存放。

    表1蛋白酶 K 溶液制备
目录号 蛋白酶 K(mg) 水 (mL)
G1N10 5 0.25
G1N70 10 0.5
G1N350 100 5.05


 程序

注意:如果在下游应用中需要最小剪切基因组 DNA,例如,如果使用最终产物进行长扩增 PCR,则通过温和移液或倒置混合至均匀,而不是在随后的程序中振荡。
 


 A. 培养细胞制备

1a. 收集细胞
• 贴壁细胞培养:用胰蛋白酶释放细胞。在 300×  g 条件下在5分钟内培养出5 × 106 个细胞;然后完全去除培养基并丢弃。继续进入步骤 2a。
• 悬浮细胞培养:在 300×  g 条件下在5分钟内培养出5 × 106 个细胞;然后完全去除培养基并丢弃。继续步骤 2a。
注意:细胞可收集并分装至 1.5 mL 微量离心管中,在液氮中快速冷冻,然后在
–70°C 条件下保存数月,至制备 DNA时取出。

2a. 重悬细胞
用 200 μL 重悬溶液彻底重悬细胞团块。如果事先冷冻,在重悬之前将细胞团块稍微解冻。如果不用担心残留RNA,可继续步骤 3a。
核糖核酸酶 A 处理(可选):如果需要无 RNA 的基因组 DNA,则可加入 20 μL 核糖核酸酶 A 溶液,室温水浴2 分钟,然后继续步骤 3a。

3a. 裂解细胞
向样品中加入 20 μL 蛋白酶 K 溶液,接着加入 200 μL 裂解液 C (B8803)。彻底振荡(约 15 秒),然后70℃ 水浴 10分钟。均匀的混合物对于高效裂解是必不可少的。继续步骤 4。
 

图1使用 GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 纯化试剂盒从细胞中纯化的基因组 DNA。

图1使用 GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 纯化试剂盒从细胞中纯化的基因组 DNA。 用 GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 纯化试剂盒从指定来源的 2 x 106 个细胞中分离纯化的基因组 DNA。在 0.8% 琼脂糖凝胶上分析基因组DNA分析基因组 DNA (200 ng/lane) 。标记物为用  Hind III 消化的 λDNA。


 B. 哺乳动物组织制备

1b. 制备组织
快速切片并称取一块新鲜或冷冻组织。切片前冰冻组织可稍稍解冻,但要放在冰上以防降解。将组织切成小块,以便更有效地裂解。每次制备可使用多达 25 mg组织(或 10 mg 的脾脏,因为每一给定质量的细胞数量多)。转移至 1.5 mL 微量离心管中,继续步骤 2b。
注意:组织可收集并分装至 1.5 mL 微量离心管中,在液氮中快速冷冻,然后在
–70°C 条件下保存数月,至制备 DNA时取出。

2b. 消化组织
向组织中加入 180μl 裂解液 T (B6678),然后加入 20μl 蛋白酶 K 溶液。振荡混匀。55℃ 水浴样品,直至组织完全消化,无颗粒残留。偶尔振荡或使用水浴摇床。消化通常在 2~4 小时内完成。消化完成后,稍加振荡。
核糖核酸酶 A 处理(可选):如果不用担心残留RNA,可继续步骤 3b。如果需要无 RNA 的基因组 DNA,则可加入 20 μL 核糖核酸酶 A 溶液,室温水浴2 分钟,然后继续步骤 3b。

3b. 裂解细胞
向样品中加入 200 μL 裂解液 C (B8803);彻底振荡(15 秒)。均匀的混合物对于高效裂解是必不可少的。70℃ 水浴10分钟。继续步骤 4。

图 2.使用 GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 纯化试剂盒从组织中纯化的基因组 DNA。

图 2.使用 GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 纯化试剂盒从组织中纯化的基因组 DNA。 用 GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 纯化试剂盒从指定小鼠组织中分离纯化的基因组 DNA。在 0.8% 琼脂糖凝胶上分析基因组 DNA (200 ng/lane) ,以说明产量和完整性。标记物为用  Hind III 消化的 λDNA。

 


 C. 啮齿动物尾部制备

1c. 制备啮齿动物尾部
快速测量并剪下一段新鲜或冷冻的啮齿动物尾巴。在切下前冷冻的啮齿动物尾巴可稍稍解冻,但要放在冰上以防降解。每次制备使用的尾巴不要超过 0.6 cm(大鼠)或 1.2 cm(小鼠)。剪下两条(小鼠)或一条(大鼠)0.5-0.6 cm 长的尾巴,放入 1.5 mL 微量离心管中;继续步骤 2c。
注意:在制备 DNA 之前,啮齿动物尾巴可以在 –20°C 条件下贮存数月。

2c. 消化组织
向鼠尾中加入 180μl 裂解液 T (B6678),然后加入 20μl 蛋白酶 K 溶液。振荡混匀;确保尾部完全浸没。55℃水浴样品,直至尾部组织完全消化。一些颗粒(骨头和毛发)可能会残留下来。培养过程中偶尔振荡或使用水浴摇床,以便更快速地消化。消化通常在 3~6 小时内完成。消化完成后,稍加振荡。如果不用担心残留RNA,可继续步骤 3。
核糖核酸酶 A 处理(可选):如果需要无 RNA 的基因组 DNA,则可加入 20 μL 核糖核酸酶 A 溶液,室温水浴2 分钟,然后继续步骤 3c。

3c. 裂解细胞
向样品中加入 200 μL 裂解液 C (B8803);彻底振荡(15 秒)。均匀的混合物对于高效裂解是必不可少的。继续步骤 4。


 D. 全血制备

1d. 采集血液
采集全血置于抗凝管中(首选 EDTA 管)。全血在开始制备前应稳定至室温。

2d. 血液制备
将 20 μL 蛋白酶 K 溶液倒入 1.5 μL 微量离心管中。向试管中加入 200 μL 全血样品。如果样品小于 200 μL,加入重悬液使体积达到 200 μL。
注意:如果样品已经分装在试管中,可以将蛋白酶 K 溶液加入到样品中。振荡以确保酶的充分混合。全血在制备 DNA 之前可在 4℃条件下保存数小时。如果不用担心残留RNA,可继续步骤 3d。
核糖核酸酶 A 处理(可选):如果需要无 RNA 的基因组 DNA,则可加入 20 μL 核糖核酸酶 A 溶液,室温水浴2 分钟,然后继续步骤3d。

3d. 裂解细胞
向样品中加入 200 μL 裂解液 C (B8803);彻底振荡(15 秒)。均匀的混合物对于高效裂解是必不可少的。55℃ 水浴 10分钟。继续步骤 4。


 E. 白细胞 (WBC) 制备

1e. 从全血中制备白细胞
每次从 500 μL 全血中制备 WBC;氯化铵裂解程序详见附录。

2e. 重悬细胞
在 200 μL 重悬溶液中彻底重悬细胞团块;向样品中加入 20 μL 蛋白酶 K 溶液并稍加振荡,以确保酶充分混合。如果不用担心残留RNA,可继续步骤 3e。
核糖核酸酶 A 处理(可选):如果需要无 RNA 的基因组 DNA,则可加入 20 μL 核糖核酸酶 A 溶液,室温水浴2 分钟,然后继续步骤3e。

3e. 裂解细胞
向样品中加入 200 μL 裂解液 C (B8803);彻底振荡。均匀的混合物对于高效裂解是必不可少的。55℃ 水浴 10分钟。继续步骤 4。


 从所有列出的样本类型中分离 DNA

这是从 a、B、C、D 和 E 部分制备的样品中继续进行的程序。

4. 柱制备
向每个预装 GenElute™微量提取吸附柱(带红色 o 型环,不要与其他 GenElute™ 试剂盒混淆)中加入 500µL 柱制备液,并以12,000  转速  离心 1 分钟。丢弃液体。
注意:柱制备溶液可最大限度地提高DNA与膜的结合,从而获得更稳定的产量。

5. 结合准备
向裂解液中加入 200 μL 乙醇 (95–100%);振荡 5-10 秒以充分混合。溶液必须混合均匀。

6. 加裂解液
从步骤 4 开始将管中的全部内容物转移到处理过的吸附柱中。在将内容物转移到吸附柱的过程中,可使用大口径移液器吸头以减少 DNA剪切。以≥6500 的 转速  离心 1 分钟。丢弃含液采集管,将吸附柱置于新的 2 mL 采集管中。

7.一次洗涤
首次使用前,请按照配制说明以乙醇稀释洗涤浓缩液。向吸附柱中加入 500 μL 洗涤液,并以≥6,500的  转速离心 1 分钟。丢弃含液采集管,将吸附柱置于新的 2 mL 采集管中。

8. 二次洗涤
再次向吸附柱中加入 500 μL 洗涤液;以最大转速 (12,000-16,000  ) 离心 3 分钟,以干燥吸附柱。洗脱 DNA 前,吸附柱必须不含乙醇。如果看到残留乙醇,以最大速度将吸附柱再离心一分钟。如果您需要此额外的离心步骤,您可以清空并重新使用采集管。最后,丢弃含液采集管,将吸附柱置于新的 2 mL 采集管中。

9. 洗脱 DNA
将 200 μL 洗脱液直接移入吸附柱的中心;以≥6,500 的 转速 离心 1 分钟 以洗脱 DNA。为提高洗脱效率,加入洗脱液后室温水浴 5 分钟,然后进行离心。

可选:二次洗脱可通过重复步骤 9,用另外的 200 μL 洗脱溶液收集,并洗脱到新的 2 mL 采集管(已提供)中或洗脱到与一次洗脱液相同的 2 mL 采集管中。

洗脱液含有纯基因组 DNA。对于 DNA 的短期贮存,建议使用 2-8°C。对于 DNA 的长期贮存,建议使用-20°C。避免冷冻和解冻,这会导致 DNA 链断裂。洗脱液将有助于在这些温度下稳定 DNA。


 DNA 沉淀(可选)

GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 试剂盒的设计使 DNA能够始终保持在溶液中,从而避免重悬问题。但是,如果您发现有必要浓缩 DNA,建议使用含乙酸钠的乙醇沉淀法。1


 结果

用 GenElute™ 试剂盒制备的基因组 DNA 的浓度和质量可以通过吸光度分析法和琼脂糖凝胶电泳法来确定。用 TE 缓冲液 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0–8.5)稀释 DNA,用石英微量吸收池测量 260 nm 和 280 nm 处的吸光度。吸光度应介于 0.1 和 1.0 之间(或在分光光度计的线性范围内)。在 260 nm 处吸光度为 1.0 相当于约 50 μg/mL 的双链 DNA。260 nm 至 280 nm 处的吸光度比值 (A260/A280) 应为 1.6-1.9。DNA 的尺寸和质量可以通过琼脂糖凝胶电泳法来确定。1 含有 0.8% 琼脂糖的凝胶(目录号:A9539)置于 0.5X TBE 缓冲液(目录号:T6400)中对于基因组 DNA 的解析效果非常好。可通过使用嵌入染料(如溴化乙锭(目录号:E1510))染色来观察DNA,并对已知 DNA 标记物(如 Hind III 消化的 λDNA EcoRI (目录号:D9281))进行测量。基因组DNA应作为单一的高分子量条带迁移,几乎没有剪切迹象。脉冲场凝胶电泳法可以更精确地测定 DNA 的尺寸。2


表 2.使用 GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 纯化试剂盒产生的产量 *
 

材料 数量 典型产量
Jurkat 细胞(人) 2 x 10 6 个细胞 5-10 µg
HEK293 细胞(人) 2 x 10 6 个细胞 10-20 µg
HeLa 细胞(人) 2 x 10 6 个细胞 15-25 µg
小鼠胰腺组织 20 mg 10-25 µg
小鼠脾脏组织 10 mg 10-25 µg
小鼠胸腺组织 16 mg 10-25 µg
小鼠肺组织 20 mg 5-15 µg
小鼠脑组织 16 mg 5-15 µg
小鼠肾组织 20 mg 10-25 µg
小鼠肝组织 25 mg 10-30 µg
用 核糖核酸酶和蛋白酶 K 处理  

图3.用 GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 纯化试剂盒纯化的基因组 DNA 适用于限制性内切酶消化。

图3.用 GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 纯化试剂盒纯化的基因组 DNA 适用于限制性内切酶消化。 基因组 DNA (200 ng) 用  EcoRI)消化(10 U在20μl溶液中以37°C消化4 小时,然后在0.8% 琼脂糖凝胶上电泳(150 ng/lane)。未消化的 DNA 在相同条件下水浴,但不用 EcoR I. 标记物为用  Hind III 消化的 λDNA。


 疑难解答指南

 

吸附柱堵塞 原因  — 样本太大。

解决方案 -将来,使用更少的细胞、更小的组织块、更小的啮齿动物尾段或更少量的全血。若要挽救当前制剂,请增加  转速和/或延长离心时间,直到裂解液通过吸附柱。基因组 DNA 的产量可能降低。
原因 -组织或啮齿动物尾巴裂解效率低。

解决方案-
延长蛋白酶 K 在 55°C 下的消化时间。为加速裂解,将组织或啮齿动物尾巴切成更小的块,并在消化过程中频繁混合,以确保更高效的裂解。蛋白酶 K 消化后倒置样品管可确保混合更加均匀。切勿使用已保存的组合溶液(蛋白酶 K+ 裂解液)。
  基因组 DNA 产量低 原因  — 样本可能陈旧或已降解,或组织裂解效率低。

解决方案 —
不同类型的细胞、组织和新鲜全血的产率不同。在培养物达到最大密度或完全融合之前使用它们。尽快收集组织或啮齿动物尾巴。在几小时内使用全血。如果样品要保存以供将来使用,请将细胞或组织在液氮中快速冷冻。全血 在4℃ 下保存时间不应超过 12 小时。
原因 -裂解液/乙醇混合物不均匀。
解决方案  — 为确保溶液混匀,在应用到吸附柱前振荡 5–10 秒。如果在下游应用中需要最小剪切基因组 DNA,例如,如果使用最终产物进行长扩增 PCR,则通过温和移液或倒置混合至均匀,而不进行振荡。
原因  —DNA 洗脱不完全。

解决方案 -
确认 DNA 是在 200 μL 洗脱液中洗脱的。将洗脱液加入吸附柱后在室温下反应 5 分钟,大多数类型材料的 DNA 产量都将有所提高。可以使用 200 μL 洗脱溶液进行第二次和第三次洗脱。
原因 -在吸附过程中省略了乙醇。
解决方案 -
在步骤 6 中将样品应用于吸附柱之前,请检查步骤 5 中是否添加了乙醇。
原因  — 洗脱液中含有洗涤液中残留的乙醇。
解决方案  —
在洗脱 DNA 之前,必须去除最后的洗涤液中残留的乙醇。离心更长时间或第二次干燥膜。如果含有乙醇的液体接触吸附柱,需在洗脱 DNA 之前重复离心步骤。
原因 -洗涤浓缩液在使用前未经稀释。
解决方案   —
使用前检查洗涤浓缩液是否用乙醇适当稀释。
原因  —DNA 用水而不是洗脱液洗脱。
解决方案 -
建议使用洗脱液洗脱,以实现纯化 DNA的最佳产率和贮存。如果用水洗脱 DNA,请确认 pH 值至少为 7.0,以避免在酸性条件下储存较长时间后DNA会被酸水解。
  DNA 的纯度低于预期; 原因 -样品在水中稀释。
解决方案 -使用洗脱液 (10 mM Tris-HCl,0.5 mM EDTA,pH 9.0) 或 10 mM Tris-HCl,pH 8.0–8.5 溶液作为洗脱液。
原因 -由于硅粉,背景读数较高。
解决方案 
— 将 DNA 样品以最大速度离心 1 分钟;使用上清液重复读取吸光度。
  DNA 的纯度低于预期;A260/A280比值太高 原因  — 基因组 DNA 被 RNA 污染。
解决方案  —
在将来的分离中加入核糖核酸酶 A 处理步骤,或用 核糖核酸酶 A溶液处理最终产物并进行再纯化。
DNA 被剪切 原因 -基因组 DNA 处理不当。
 
解决方案  —
本试剂盒的设计可消除其他基因组 DNA 试剂盒中发现的可导致DNA剪切的 DNA 沉淀和常见重悬步骤。所有移液步骤应尽可能温和地执行。建议使用大口径移液器吸头,以帮助消除剪切。如果在下游应用中需要最小剪切基因组 DNA,例如,如果使用最终产物进行长扩增 PCR,则通过温和移液或倒置混合至均匀,而不进行振荡。
原因 -样品陈旧、降解或已经历反复的冷冻/解冻过程。

解决方案 -旧的起始材料可能在洗脱液中产生降解DNA。应立即使用新鲜细胞和组织、鼠尾及全血制剂。或者,细胞和组织可以在液氮中冷冻并保存在-70°C 条件下,直至需要时取出。鼠尾可在-20℃条件下保存数周或-70℃ 条件下保存数月。全血可在 4℃ 条件下保存长达 12 小时。
  下游应用被抑制 原因 -乙醇被带入最终的基因组 DNA 制剂中。
 
解决方案
 — 在最后一次洗涤吸附柱后(步骤 8),不要让洗涤液接触吸附柱。在排空采集管后,如有必要,以最大转速 (12,000–16,000  ) 重新离心吸附柱 1 分钟。

原因 -盐被带入最终的基因组 DNA 制剂中。 解决方案  —在步骤 8 中添加洗涤液之前,确保将吸附柱转移到新的 2 mL 采集管中。


 附录:从全血中分离白细胞的氯化铵裂解程序

  1. 在抗凝管中采集全血。
  2. 向 1 mL 氯化铵裂解液中加入 500 μL 全血 *。在室温下轻轻混合(倒置或在摇床上)5 分钟,然后在微量离心机中以 700的转速  离心 5 分钟。
  3. 弃上清液。将细胞团块轻柔重悬于另一毫升氯化铵溶解液中;按照步骤 2 温和混合并离心。弃去上清液,细胞团块置于冰上并重新开始白细胞程序 (1e)。
*氯化铵溶解液:
160 mM 氯化铵(目录号:A9434),20 mM 碳酸氢钠(目录号:S7277);用盐酸将 pH调至 7.2。

 


 材料

     


 注意事项和免责声明

GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 试剂盒仅供实验室使用,不适用于药物、家庭或其他用途。裂解液 C 中含有离液盐,这是一种刺激物。柱制备液为刺激性物质。避免接触皮肤。处理这些溶液或随试剂盒提供的任何试剂时,请戴上手套、安全眼镜和合适的防护服。有关危险和安全操作规范的信息,请参阅安全数据表 (SDS)