测定羟脯氨酸的酶学方法(羟脯氨酸测定)

 引言

本测定实验方案适用于利用葡萄糖和蔗糖测定试剂盒(MAK013)对细胞和组织培养物上清液、尿液、血浆、血清和其他生物样品中的葡萄糖和蔗糖进行比色 / 荧光检测。在该测定试剂盒中,葡萄糖通过葡萄糖氧化酶被氧化,产生比色(570 nm)/ 荧光(λex= 535 nm / λem= 587 nm)产物,与存在的葡萄糖成比例。为了测量蔗糖,将转化酶加入到反应中以将蔗糖转化为葡萄糖和果糖。可从总葡萄糖中减去游离葡萄糖,得到存在的蔗糖浓度。对于荧光测定,该试剂盒在0.2-1.0 nmol葡萄糖之间具有线性检测范围,对于比色测定,在2-10 nmol葡萄糖之间具有线性检测范围。 
 

 试剂

葡萄糖测定缓冲液                    25 mL
货号:MAK013A

葡萄糖探针,在DMSO中           0.2 mL
货号:MAK013B

转化酶                                    1 vL
货号:MAK013C

葡萄糖酶混合物                       1 vL
货号:MAK013D

蔗糖标准品,100 nmole/μL       0.1 mL
货号:MAK013E
 

 需要但未提供的试剂和设备:

96孔平底板 — 建议使用底部透明的黑板(货号:M5686或等效物)进行荧光测定,或者使用透明板(货号:M4436或等效物)进行比色测定。

荧光或分光光度计多孔板读数器
 

 制备说明

葡萄糖测定缓冲液 — 使用前使缓冲液达到室温。

葡萄糖探针 — 即用型,按供应原样使用。使用前让探针达到室温。避光保存在-20°C,2个月内用完。

葡萄糖酶混合物和转化酶 — 在220 μL葡萄糖测定缓冲液中复苏每种酶。通过移液充分混合,然后等分,并在-20°C下避光保存。复苏后2个月内用完,使用时保持低温。
 

 储存 / 稳定性

本试剂盒采用冰袋运输。建议-20 °C避光保存。
 

 操作步骤

所有的样品和标准品均应一式两份。

用于比色检测的蔗糖标准品

用990 μL葡萄糖测定缓冲液稀释10 μL100 nmole/μL蔗糖标准溶液,以制备1 nmole/μL标准溶液。将0、2、4、6、8和10 μL的1 nmole/μL蔗糖标准溶液加入96孔板中,产生0(测定空白)、2、4、6、8和10 nmole/孔的标准品。向每个孔中加入葡萄糖测定缓冲液,使体积达到50 μL。

用于荧光检测的蔗糖标准品

按比色测定中的操作步骤,制备1 nmole/μL标准溶液。用180 μL葡萄糖测定缓冲液稀释20 μL的1 nmole/μL标准溶液,以制备0.1 nmole/μL标准溶液。将0、2、4、6、8和10 μL的0.1 nmole/μL蔗糖标准溶液加入96孔板中,产生0(测定空白)、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0、nmole/孔的标准品。向每个孔中加入葡萄糖测定缓冲液,使体积达到50 μL。

样品制备

液体样品可以直接测量。添加葡萄糖测定缓冲液,使样品最后定容50 µL。

对于未知样品,建议尝试几种不同的样品稀释度以保证读数在标准曲线的线性范围内。

对于蔗糖检测,为每个样品在板孔中设置一式两份用于测量葡萄糖。这些板孔将用于确定总葡萄糖量。 

测定反应

1. 向每个蔗糖样品和蔗糖标准品中加入2 μL的转化酶。向葡萄糖样品中加入2 μL葡萄糖测定缓冲液。将板在37°C下孵育30分钟。

2. 根据表1中的方案设置反应预混液,每个反应(孔)需要50 μL反应预混液。

表格1.

反应混合物
 

试剂 体积
葡萄糖测定缓冲液 46 µL
葡萄糖探针 2 µL
葡萄糖酶混合物 2 µL

3. 向每个孔中加入50 μL反应预混液。使用水平摇床或者通过移液完全混合,然后在37℃下孵育反应物30分钟。在孵育期间需避免使板受光。

4. 对于比色测定,测量570 nm处的吸光度(A570)。对于荧光测定,测量荧光强度(λex = 535 / λem = 590nm)。
 

 结果

计算

测定的背景是0(测定空白)蔗糖标准品获得的值。从所有读数中减去0(测定空白)的值来相对背景进行校正。背景值可以很严重,必须从所有读数中减去。使用从适当的蔗糖标准品获得的值绘制标准曲线。

注意:每次测定都必须建立新的标准曲线。

葡萄糖和蔗糖的浓度

        Sa/Sv = C

Sa = 来自标准曲线的未知样品中的葡萄糖量(μg)
Sv = 加入板孔中的样品体积(μL)
C = 样品中葡萄糖的浓度

样品计算

葡萄糖量(Sa)= 5.84 nmole
(来自标准曲线)
样品体积(Sv)=50 μL

样品中葡萄糖的浓度

5.84 nmole/50 µL = 0.1168 nmole/µL

0.1168 nmole/µL x 180.6 ng/nmole=21.09 ng/µL

蔗糖 = 总葡萄糖 - 游离葡萄糖

 

 材料