HL-1细胞


 订货信息

 

产品名称 外部供应商 货号
HL-1心肌细胞系 SCC065
Claycomb培养基 51800C
胎牛血清 TMS-016
青霉素-链霉素(104 U/ml青霉素和104 μg/ml链霉素) P4333
去甲肾上腺素 [(±)-动脉醇(Arterenol)] A0937
L-抗坏血酸,钠盐 A7506
L-谷氨酰胺,200 mM G7153
胰蛋白酶-EDTA(0.05%胰蛋白酶,在0.02%EDTA-Na中) T3924
胰蛋白酶抑制剂 I-S 型,黄豆 T6522
Dulbecco PBS(不含Ca2+和Mg2+ D8537
纤连蛋白(1 mg/ml) F1141
牛皮明胶** G9391
蒸馏水,细胞培养级 W3500
冷冻管,2 ml,圆底 有,康宁 430289
无菌针头过滤器,0.2 μm 有,Gelman Sciences 4192
冷冻容器 有,Nalgene 7-5100-0001

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 注意事项

处理或补充这种培养基时须使用无菌技术。该产品用于研究或进一步制造用途。本产品不适用于人体或治疗用途。


 储存

需将培养基避光保存在2至8°C下。


 变质的迹象

培养基应该清澈,无颗粒和絮状物质。如果培养基混浊或含有沉淀物,请勿使用。其他变质迹象可能包括颜色变化、pH变化、或者物理或性能特性降低


 含补剂的Claycomb培养基

 

产品名称 ml 最终浓缩
Claycomb培养基 87  
胎牛血清 10 10%
青霉素 / 链霉素 1 100 U/ml:100 µg/ml
去甲肾上腺素(10 mM原液) 1 0.1 mM
L-谷氨酰胺(200 mM原液) 1 2 mM
  • 将Claycomb培养基瓶子包裹在铝箔中,因为该培养基对光线极为敏感。
  • 含补剂的Claycomb培养基有效期为两周,此时补充L-谷氨酰胺。


 去甲肾上腺素 [(±)-动脉醇(Arterenol),mw 319.3

  • 去甲肾上腺素由30 mM抗坏血酸组成。
  • 向100 ml细胞培养级蒸馏水中加入0.59 g抗坏血酸,制成100 ml 30 mM抗坏血酸溶液。
  • 向25 ml 30 mM抗坏血酸中加入80 mg去甲肾上腺素。
  • 用0.2 μm Acrodisc针头过滤器进行过滤除菌。
  • 将1 ml体积等分到带螺旋盖的无菌微管中,并储存在-20°C。这是10 mM(原液)去甲肾上腺素。每100 ml培养基使用1 ml原液,终浓度为0.1 mM。
  • 去甲肾上腺素需要每月新鲜制备


 L-谷氨酰胺

  • L-谷氨酰胺以100x溶液形式供货,等分成工作体积并冷冻保存。


 冷冻培养基

  • 冷冻培养基由95% FBS / 5% DMSO组成。
  • 这可在4°C下储存一周。


 黄豆胰蛋白酶抑制剂

  • 称取25 mg黄豆胰蛋白酶抑制剂,并置于含有100 ml Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS;不含Ca2+和Mg2+)的烧杯中直至溶解。
  • 用0.2 μm针头过滤器将其过滤除菌至100 ml瓶中。
  • 这可以在4°C下保质一个月。


 预包被烧瓶

明胶 / 纤连蛋白

  • 称取0.1 g明胶,放入500 ml玻璃瓶中。
  • 添加蒸馏水至500 ml标记处,然后高温高压灭菌。这种明胶在高温高压灭菌过程中会变成溶液。明胶浓度为0.02%。
  • 纤连蛋白(1 mg/ml)是以液体形式装在试管中供货的。在199 ml 0.02%明胶中稀释1 ml纤连蛋白。轻轻混合,然而立即将6 ml等分到贴有标签的各个15 ml离心管中。将等分试样在-20°C冷冻保存。
  • 在培养细胞之前,用明胶 / 纤连蛋白(1 ml/T25或3 ml/T75烧瓶)包被组织培养瓶。盖上烧瓶盖子,在37°C下孵育至少一小时。
  • 在即将把细胞添加到烧瓶之前,吸去明胶 / 纤连蛋白。


 培养细胞

  • 每个工作日用含补剂的Claycomb培养基饲喂培养物(5 m/T25烧瓶)。
  • 为避免在周末饲喂细胞,周五下午向每个T25烧瓶中加入10 ml含有补剂的Claycomb培养基,直到下周一早上才更换培养基。


 传代 — 1:2分瓶的程序步骤

  • 当细胞到货后,建议在细胞达到汇合时将它们分瓶。
  • 每个T25烧瓶按1:2分瓶,共分成四个T25烧瓶。将这四个T25烧瓶中的一个作为您的“工作”细胞。
  • 当剩余的三个T25烧瓶中的细胞在三天后达到汇合时,以1:3将它们分成3个T75烧瓶,然后冷冻保存。我们建议至少冷冻3个T75烧瓶。
  • 因此,在收到HL-1细胞一周以后,您应该有三个冷冻管的细胞冷冻起来以备后用。
  • 建议只在达到完全汇合后才将培养物分瓶。
  • 用加热至37°C的3 ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)简短冲洗每个T25烧瓶(如果是T75,则用6 ml),操作方法是将PBS吸移到烧瓶底部(盖子的对面),尽量不要直接冲击细胞。轻轻冲洗,然后吸除。
  • 在每个T25烧瓶中加入1 ml预热的0.05%胰蛋白酶 / EDTA(每个T75则用3ml)。在室温下孵育1分钟。
  • 去除旧液,然后添加新鲜的0.05%胰蛋白酶 / EDTA。在室温下孵育另外2分钟。
  • 用显微镜检查,如果细胞仍然贴附,则在工作台面上轻敲烧瓶以使贴壁细胞脱落。
  • 为了使酶失活,加入等量(每个T25 1 ml)的黄豆胰蛋白酶抑制剂。
  • 将细胞从烧瓶转移到15 ml离心管中。
  • 用5 ml洗涤培养基(仅含5% FBS和青霉素 / 链霉素的Claycomb培养基)冲洗空烧瓶,并加入到已装有细胞的15 ml离心管中。
  • 以500 × g离心5分钟。
  • 期间,从每个T25烧瓶中去除明胶 / 纤连蛋白溶液,并在每个烧各加入4 ml含有补剂的Claycomb培养基。搁置一边。
  • 从离心机上取下含有HL心肌细胞的试管。吸除上清液,将沉淀物轻轻地重悬于2 ml含有补剂的Claycomb培养基中。
  • 将1 ml细胞悬液转移到两个贴好标签的明胶 / 纤连蛋白包被的T25烧瓶中。现在每个烧瓶含有5 ml内容物。
  • 如果细胞在星期五传代,则每个烧瓶用2倍体积的含有补剂的Claycomb培养基。


 冷冻

建议您在收到细胞后,尽快冷冻3小管或更多(请参阅“传代”部分的说明)。这样让您返回到这个过程,并可以防止发生污染(This allows you to return to this passage, and also protects you in case of contamination)。

  • 我们通常将一个汇合的T75烧瓶中的内容物放入一个冷冻管里冷冻。(当需要细胞时,就将这个冷冻管解冻到一个T75烧瓶中。)
  • 用加热至37°C的5 ml PBS短暂冲洗装有HL-1培养物的T75烧瓶。吸除溶液。
  • 将3 ml 0.05%胰蛋白酶 / EDTA转移到烧瓶中。
  • 将烧瓶在37°C孵育1分钟。
  • 从烧瓶中去除胰蛋白酶 / EDTA,再换上3 ml新鲜的0.05%胰蛋白酶 / EDTA。
  • 在37°C孵育2分钟。
  • 在显微镜下检查细胞是否脱落。如果没有,则在工作台面上轻敲烧瓶以使任何贴壁细胞脱落。
  • 向烧瓶中加入3 ml黄豆胰蛋白酶抑制剂,将6 ml转移到15 ml离心管中。
  • 用8 ml洗涤培养基冲洗每个空烧瓶,并加入到已装有细胞的15 ml离心管中。
     总体积现在是14 ml。
  • 将管以500 × g离心5分钟。
  • 吸除洗涤培养基。
  • 将每个管中的沉淀轻轻重悬于1.5 ml冷冻培养基(95% FBS / 5% DMSO)中。
  • 将重悬的细胞移液到冷冻管中。将含有细胞的冷冻管放入含有室温异丙醇的Nalgene冷冻罐中。
  • 立即将冷冻罐放入-80°C冰箱中,使细胞以-1°C /分钟的速度冷冻。
  • 6至12个小时以后,将小管转移到液氮杜瓦瓶中。


 解冻

  • 明胶 / 纤连蛋白 — 包被T75组织培养瓶,然后置于37℃培养箱孵育至少1小时。
  • 从培养瓶中除去明胶 / 纤连蛋白,换成10 ml含有补剂的Claycomb培养基。将该烧瓶放回培养箱中。
  • 将10 ml洗涤培养基转移到空的15 ml离心管中。将管在37°C水浴中孵育。
  • 在37°C水浴中快速解冻细胞(约2分钟),然后转移到含有洗涤培养基的15 ml离心管中。
  • 以500 × g离心5分钟。
  • 从离心机上取下试管,吸除洗涤培养基。
  • 将沉淀轻轻重悬于5 ml含有补剂的Claycomb培养基中,然后加入已装有10 ml培养基的T75烧瓶中。
  • 4小时后(在细胞附着后)用15 ml新鲜的含有补剂的Claycomb培养基更换培养基。


 特性

外观 — 清澈的橙红色溶液

内毒素 — 参见分析证书

渗透压(如所提供的)— 参考分析证书

pH(如所提供的)— 7.1 - 7.4

无菌性 — 未检测到微生物生长


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 参考文献

1. Claycomb, W., et al., (1998). Proc. Natl. Acad. Sci., 95:2979