使用Jumpstart™Taq DNA聚合酶 (D9307)扩增DNA

操作步骤

:JumpStart Taq DNA聚合酶已经证明可与高达5%(v / v)的DMSO高效配合使用。 其他共溶剂、溶质(例如盐)和pH或其他反应条件可能降低JumpStart Taq抗体对TaqDNA聚合酶的亲和力,从而破坏其有效性。

PCR预混液制备及热循环参数

由于Taq DNA聚合酶是镁离子依赖性酶,因此Taq酶、模板DNA、引物和MgCl2浓度的最佳条件会因所用系统而异,并且可能需要单独确定每个单一组分的最佳条件。对于JumpStart Taq酶,尤其需要确定最佳的循环参数和MgCl2浓度。建议对酶和MgCl2浓度进行滴定以确定最佳反应效率。

为了最大限度地减少管之间转移误差,建议制备含有JumpStart Taq 的PCR预混液。制备量应基于待进行的PCR反应物数量而定。

 

1.  对于单一反应,按以下顺序将以下试剂添加至0.2或0.5 ml微管中:

 

体积 组分 终浓度
µL
5 µL 10x PCR缓冲液 1x
1 µL* 10 mM dATP 200 µM
1 µL* 10 mM dCTP 200 µM
1 µL* 10 mM dGTP 200 µM
1 µL* 10 mM TTP 200 µM
y µL 引物 0.1-0.5 µM
1 µL JumpStart Taq DNA聚合酶 0.05 units/µL
z µL 模板DNA(通常10 ng) 200 pg/µL
50 µL 总反应物体积

*各个核苷酸(每种10 mM溶液各1μL,共4μL)可以用1μL脱氧核苷酸混合物(货号D7295)代替。

 

2. 轻轻混合并短暂离心,收集管底部所有溶液。

3. 在每个管顶部添加50 μL矿物油以防蒸发(可选,取决于热循环仪的型号)。

4. 扩增参数取决于引物和所用的热循环仪。可能需要针对单个引物、模板和热循环仪对反应体系进行优化。

典型的循环参数:

 

初始变性 94 °C 1 min
25-35个循环:    
变性 94 °C 30 sec
退火 55–68 °C 30 sec
延伸 72 °C 1 min(最小值)*
最终延伸: 72 °C 1 min(最小值)*
保温 4 °C  

*每kb预期扩增子需要不少于1分钟或1分钟。

5. 扩增的DNA可以通过琼脂糖凝胶电泳和随后的溴化乙锭染色进行检测。可以通过单次氯仿萃取(1:1)以除去矿物油覆盖层,并回收水相。

 

故障排除指南

问题   建议  
使用JumpStart Taq时未观察到非特异性产物的减少。 使用手动热启动方法测试PCR系统。
建议JumpStart Taq不要和浓度超过5%(v / v)的DMSO或任何其他添加剂同用,因为这些试剂可能会干扰酶-抗体复合物形成。其他共溶剂、溶质(例如盐)和pH或其他反应条件可能会降低JumpStart Taq抗体对Taq DNA聚合酶的亲和力,从而破坏其有效性。
JumpStart Taq PCR和手动热启动PCR均产生多种非特异性产物。 以2-3°C的增量升高退火温度。提高温度可提高引物结合特异性;但这样可能导致引物结合和延伸减少。如果提高退火温度导致特定产物产率降低,并且副反应产物也成比例减少,则可能需要重新设计引物1
采取特殊预防措施,避免使用特异性和非特异性PCR产物(包括人为引物二聚体)对PCR反应进行交叉污染2  
JumpStart TaqPCR比手动热启动PCR产生更多的非特异性产物。 JumpStart Taq滴定对于优化PCR反应条件来说是必不可少的——特别是您所用的条件与本文档所述存在出入时。这种情况下,建议使用含有比推荐浓度高两到四倍的JumpStart Taq的工作溶液。
使用JumpStart Taq时,特异性产物的产量很低。 将反应体积增加至150 μL或更多。
增加扩增循环次数。如果当前使用25-30个循环,则将循环次数增加到35-40。该过程只会增加产量而不会显著增加副反应产物。
修改反应条件和/或PCR靶标的选择性以获得更多的PCR引发机会。 例如,将变性时间增加至1-1.5分钟和/或将变性温度增加至95℃以克服变性困难的问题。
建议JumpStart Taq不要和浓度超过5%(v / v)的DMSO或任何其他添加剂同用,因为这些试剂可能会干扰酶-抗体复合物形成。

 

材料

     

 

参考文献

  1. Huang, L. M., and Jeang, K.-T., BioTechniques 16, 242-246 (1994).
  2. Kwok, S., and Higuchi, R.,  Nature 339, 237-238 (1989).

一般文献

  • Griffin, H. G. and Griffin, A. M. (Eds.) PCR Technology: Current Innovations, (CRC Press, 1994).
  • Innis, M. A., et al. (Eds.)  PCR Strategies, (Academic Press, New York, 1995).
  • Innis, M., et al. (Eds.)  PCR Protocols:  A Guide to Methods and Applications, (Academic Press, San Diego, California, 1990).
  • Newton, C. R.  (Ed.)  PCR: Essential Data, (John Wiley & Sons, New York, 1995).
  • Sambrook, J. F., et al.  Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2000.

JumpStart位Sigma-Aldrich Co. LLC的商标。

 

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