人表皮黑素细胞(HEM)培养方法

I. 储存

A. 冷冻保存的小管 (104-05a, 104-05n)

收货后立即将冷冻管储存在液氮储罐中。

*从液氮储罐中取出冷冻管时,务必戴上面罩和手套。从储罐到室内的剧烈温度变化可能导致冷冻管中的任何残留的液氮爆裂并造成伤害。

Human Epidermal Melanocytes (HEM)

人表皮黑素细胞(HEM)

 

II. 培养准备

  1. 确保带有HEPA过滤层流气流的II级生物安全柜处于正常工作状态。
  2. 用70%酒精对生物安全柜进行消毒。
  3. 在开始细胞培养工作之前,打开生物安全柜鼓风机10分钟。
  4. 确保所有血清移液器、移液器吸头和试剂溶液都是无菌的。
  5. 遵循标准灭菌技术和安全规则:

a. 不要用嘴进行移液。

b. 在使用人体细胞时,即使所有细胞都经过检测为HIV、乙型肝炎和丙型肝炎阴性,都请始终戴上手套和安全眼镜。

c 在无菌罩中进行所有细胞培养工作。

 

III. HEM培养

A.准备用于HEM培养的细胞培养瓶

1.      从冰箱中取出黑素细胞生长培养基。在无菌罩中用70%酒精擦净瓶子。

2.      将15 ml黑素细胞生长培养基*移液至T-75培养瓶中。

*保持培养基与表面积之比为每5 cm2 1 ml。

例如:

T-25 培养瓶60 mm 组织培养皿中加入5 ml培养基。

T-75 培养瓶100 mm 组织培养皿中加入15 ml培养基。

B.解冻和接种HEM

1.     使用适当的眼睛和手的保护措施,从液氮储罐中取出冷冻保存的HEM小管。

2.     将管盖转动四分之一圈,以释放可能残留在螺纹中的液氮,然后重新拧紧管盖。

3.     将小管的下半部分放在37°C水浴中快速解冻细胞,并在解冻过程中密切观察小管。

4.     当样品管中仅留有少量冰时,从水浴中取出样品瓶。不要让细胞完全解冻。

5.     在无菌生物安全柜中用70%酒精擦净小管外部。

6.     小心取下样品管盖。请勿用手触摸盖子或小管的边缘,以免污染。

7.     用2 ml移液管轻轻吸打5次,以将细胞重悬于小管中。小心不要过于剧烈地吸打以防起泡。

8.     将细胞悬浮液(1 ml)从小管中移液至含有15 ml黑素细胞生长培养基的T-75培养瓶中。

9.     盖上培养瓶并轻轻摇动,使细胞均匀分布。

10.   将T-75培养瓶放入37℃,5%CO2湿润的培养箱中。松开瓶盖以允许气体交换。为获得最佳结果,接种后24小时不要扰动培养。

11.   24小时或过夜后转换为新鲜的黑素细胞生长培养基以除去所有残留的DMSO。

12.   每隔一天更换黑素细胞生长培养基,直到细胞达到60%融汇。

13.   当培养细胞> 60%融汇或需要周末培养时,可加倍黑素细胞生长培养基的体积。

14.   当HEM培养达到80%融汇时,将细胞进行传代培养。

 

IV. HEM传代

A. 准备传代培养试剂

  1. 从-20°C冰箱中取出胰蛋白酶-EDTA溶液和胰蛋白酶抑制剂,并在冰箱中解冻过夜。
  2. 确保所有传代培养试剂已完全解冻。轻轻旋涡震荡每个瓶子几次,以形成均匀的溶液。
  3. 将所有传代培养试剂储存在4°C以备将来使用。
  4. 如果只需要一部分胰蛋白酶/ EDTA,可等分胰蛋白酶/ EDTA溶液,并将未使用的部分保存在-20°C。

B. 准备培养瓶

  1. 从冰箱中取出黑素细胞生长培养基。在无菌罩中用70%酒精擦净培养瓶。
  2. 将30 ml黑素细胞生长培养基移至T-175培养瓶中(用于第IV C部分步骤15)。

C. 传代培养HEM

在室温下胰蛋白酶消化细胞。不要将任何试剂加热至37°C。

  1. 通过抽吸从培养瓶中取出培养基。
  2. 用HBSS洗涤单层细胞并通过抽吸除去溶液。
  3. 将5 ml胰蛋白酶/ EDTA溶液移液到T-75培养瓶中。轻轻摇动培养瓶以确保溶液覆盖所有细胞。
  4. 立即取出4毫升溶液。
  5. 重新盖上培养瓶并用倒置显微镜在室温下监测胰蛋白酶消化过程。细胞通常需要约2至4分钟才能变圆。在胰蛋白酶消化过程中细胞可能不会完全变圆,并且即使它们从培养瓶表面松散下来,一些细胞也扔可能保持一些过程。
  6. 通过将培养瓶侧面贴在手掌上以释放圆形细胞,直至大部分细胞从培养瓶上脱落。
  7. 向培养瓶中加入5 ml胰蛋白酶抑制剂溶液以抑制进一步的胰蛋白酶活性。
  8. 将细胞悬浮液从培养瓶中转移至50 ml无菌锥形管中。
  9. 用另外的5 ml胰蛋白酶抑制剂溶液冲洗培养瓶,并将溶液转移到相同的锥形管中。
  10. 在显微镜下检查T-75培养瓶。如果烧瓶中剩余> 20%的细胞,请重复步骤2-9。
  11. 将锥形管以220×g离心5分钟以沉淀细胞。
  12. 从管中吸出上清液,并避免扰动细胞沉淀。
  13. 用手指轻弹锥形管的尖端以松开细胞沉淀。
  14. 通过轻轻吹打细胞以破碎团块,将细胞重悬于5 ml黑素细胞生长培养基中。
  15. 用血细胞计数器或细胞计数器计数细胞。以10,000个细胞/ cm2接种以实现快速生长,或以每平方厘米6,000个细胞接种以进行常规传代培养。

材料