人毛囊真皮乳头细胞

I. 储存

A. 冻存管 (602-05a)

收到细胞后,立即将冻存管储存在液氮罐中。

*从液氮罐取出冻存管时,务必佩戴防护面罩和手套。从液氮罐到室内的剧烈温度变化可能会导致冻存管中滞留的液氮爆炸并造成伤害。

602-05a-cells

人毛囊真皮乳头细胞(HFDPC)

 

II. 细胞培养准备工作

  1. 确保具有HEPA过滤层流的II级生物安全柜处于良好的工作状态。
  2. 使用70%酒精对生物安全柜进行消毒。
  3. 开始细胞培养工作之前,提前10分钟打开生物安全柜吹风机。
  4. 确保所有血清学移液器、移液管和试剂溶液都是无菌的。
  5. 遵守标准无菌技术和安全规则:
    a.    不要用嘴吸移液管。
    b.    在处理人类细胞时始终佩戴手套和护目镜,即使所有菌株均已经过测试为HIV、乙肝和丙肝病毒阴性。
    c.    在无菌超净台内处理所有细胞培养工作。

III. HFDPC培养

A. 为HFDPC培养准备细胞培养瓶

  1. 从冰箱中取出胶原蛋白包被T-75培养瓶125-75)和毛囊真皮乳头细胞生长培养基(611-500),并静置恢复室温。
  2. 在无菌超净台内使用70%酒精对培养基瓶和细胞培养瓶消毒。
  3. 吸取15 ml 毛囊真皮乳头细胞生长培养基 611-500)* 置于胶原蛋白包被T-75培养瓶 125-75)中。
    *保持培养基与表面积的比例在1-1.5ml:5 cm2之间。
    - 一个 T-25培养瓶SIAL0639)或一个  60 mm组织培养皿  (SIAL0166) 使用5ml培养基。
    - 一个 T-75培养瓶 (SIAL0641)或一个 100 mm组织培养皿 (SIAL0167)使用15ml培养基。

B. 解冻和接种HFDPC

  1. 准备一个15ml无菌锥形管并加入12 ml 毛囊真皮乳头细胞生长培养基611-500),用于清洗HFDPC。
  2. 佩戴合适的护目镜和手套,从液氮罐中取出HFDPC冻存管。
  3. 迅速将冻存管下半部分放在37°C水浴中解冻细胞,并在解冻过程中密切观察冻存管。
  4. 当冻存管内仅剩下少量冰时,从水浴中取出冻存管。不要让细胞完全解冻。
  5. 从水浴中取出冻存管并擦干。
  6. 在无菌生物安全柜中,用70%酒精对瓶身消毒。
  7. 小心取下管盖。不要触碰管盖或冻存管的边缘。
  8. 使用2 ml移液管轻轻吹打管内细胞5次,使细胞分散。小心不要吹打过猛,以免产生泡沫。
  9. 用移液管从冻存管中取出细胞悬液(1ml)并轻轻转移至准备好的15 ml锥形管中。
  10. 室温200 x g离心5分钟,使细胞沉至管底。
  11. 吸出管中的上清液,不要破坏细胞沉淀。
  12. 用移液管轻轻吹打细胞以分散细胞团块,使细胞重悬于2ml 毛囊真皮乳头细胞生长培养基611-500)中。
  13. 将2ml细胞混悬液转移至含15ml毛囊真皮乳头细胞生长培养基611-500)的胶原蛋白包被T-75培养瓶125-75)中。
  14. 紧紧盖上瓶盖,轻轻旋转培养瓶,使细胞均匀分布在瓶中。
  15. 将T-75培养瓶放在37oC、5% CO2恒湿培养箱中。松开瓶盖,以便气体交换。
  16. 每隔一天更换毛囊真皮乳头细胞生长培养基611-500),直至细胞达到60%融合。
  17. 当培养细胞融合率达到60%以上或周末无换液培养时,将毛囊真皮乳头细胞生长培养基611-500)用量加倍。
  18. 当HFDPC达到80%融合时,进行细胞传代。

 

IV. FDPC传代培养

A. 准备传代试剂

1.从-20°C冰箱中取出 胰蛋白酶-EDTA溶液T3924)和 胰蛋白酶抑制剂T6414),置于4°C冰箱中解冻过夜。

2.确保所有传代试剂均解冻。将每个瓶子轻轻旋转几下,将溶液混合均匀。

3.将所有传代试剂放在4°C,以供未来使用。

4.分装 胰蛋白酶-EDTA溶液T3924)。如果只需要使用一部分 胰蛋白酶-EDTA溶液T3924),则将未使用部分保存在-20°C。

 

B. 准备培养瓶

1.将胶原蛋白包被溶液 125-50)轻轻旋转几次,将溶液混合均匀。

2.从冰箱中取出毛囊真皮乳头细胞生长培养基611-500)。在无菌超净台中使用70%酒精对瓶身进行消毒。

3.在 T-225培养瓶CLS431082)中加入10 ml胶原蛋白包被溶液125-50),然后轻轻摇动培养瓶,使溶液均匀分布在全部培养表面。

4.在室温下包被培养皿1-2小时。

5.在无菌超净台中,吸出胶原蛋白包被溶液125-50)。

6.使用 Dulbecco磷酸盐缓冲生理盐水 D8537)清洗包被培养瓶三次,最后一次清洗时从培养瓶中吸出全部清洗液。包被培养瓶可立即使用或装在密封袋中置于4°C保存最长2周。

7.吸取45ml毛囊真皮乳头细胞生长培养基611-500)置于该包被 T-225培养瓶CLS431082)中,作为用于传代培养的包被培养瓶,并等待接种。

 

B. HFDPC传代培养

在室温下用胰蛋白酶消化细胞。不要将任何试剂预热至37°C。

1. 吸取出培养瓶中的培养基。

2. 使用HBSS (H6648)清洗单层细胞,并吸出溶液。

3. 取5 ml 胰蛋白酶-EDTA溶液T3924)置于T-75培养瓶中。轻摇培养瓶,使溶液覆盖所有细胞。

4. 立即取出4.5 ml溶液。

5. 将瓶盖拧紧,并在室温下使用倒置显微镜观察胰酶消化过程。细胞通常需要1-3分钟才能变圆。

6. 用培养瓶一侧撞击手掌,使变圆的细胞从培养表面脱落,直至大多数细胞脱落下来。

7. 向培养瓶中加入5 ml胰蛋白酶抑制剂T6414),以抑制进一步的胰酶消化活性。

8. 将培养瓶中的细胞悬液转移至50ml无菌锥形管中。

9. 再次向培养瓶中加入5 ml胰蛋白酶抑制剂T6414)进行清洗,并将溶液转移至相同的锥形管中。

10. 在显微镜下检查T-75培养瓶。如果有20%以上的细胞残留在瓶内,则重复步骤2-9。

11. 将锥形管以220 x g离心5分钟,使细胞沉淀

12. 吸出管内上清液,不要破坏细胞沉淀。

13. 用手指轻弹锥形管的尖端,使细胞团块松散开。

14. 用移液管轻轻吹打细胞以分散细胞团块,使细胞重悬于2ml毛囊真皮乳头细胞生长培养基611-500)中。

15. 使用细胞计数板或细胞计数仪计数细胞。若需要细胞快速生长,则以10,000个细胞/ cm2 的密度接种细胞;若需要常规传代,则以6,000个细胞/ cm2 的密度接种细胞。

 

材料