人前脂肪细胞(HPAd)培养方案

I. 储存

A. 冻存管 (802s-05a, 802h-05a, S802s-05a)

收到后立即将冻存管保存在液氮储存罐中。

*从液氮储存罐中取出冻存管时,务必佩戴防护面罩和手套。从液氮罐到房间的剧烈温度变化可能会导致冻存管中滞留的液氮爆炸并造成伤害。

 

802h-05a-cells

人前脂肪细胞 (HPAd)

 

II. 细胞培养准备工作

  1. 确保具有HEPA过滤层流的II级生物安全柜处于良好的工作状态。
  2. 使用70%酒精对生物安全柜进行消毒。
  3. 开始细胞培养工作之前,提前10分钟打开生物安全柜吹风机。
  4. 确保所有血清学移液器、移液管和试剂溶液无菌。
  5. 遵守标准无菌技术和安全规则:

a. 不要用嘴吸移液管。

b.在处理人类细胞时始终佩戴手套和护目镜,即使所有菌株均已经过测试为HIV、乙肝和丙肝病毒阴性。

c.在无菌超净台内处理所有细胞培养工作。

 

III. HPAd培养

A. 为HPAd培养准备细胞培养瓶

  1. 从冰箱中取出 人前脂肪细胞生长培养基811-500)。在无菌超净台内使用70%酒精对培养基瓶身消毒。
  2. 吸取15 ml人前脂肪细胞生长培养基811-500)*置于 T-75培养瓶SIAL0641)中。

* 保持培养基与表面积的比例为1ml:5 cm2

例如:

- 一个 T-25培养瓶(SIAL0639)或一个 60 mm组织培养皿 (SIAL0166)使用5ml培养基。

- 一个 T-75培养瓶SIAL0641)一个 100 mm组织培养皿 (SIAL0167)使用15ml培养基。

B. 解冻和接种HPAd

  1. 佩戴合适的护目镜和手套,从液氮罐中取出HPAd冻存管。
  2. 将管盖旋开四分之一周,将可能滞留在管盖螺纹处的液氮释放出来,然后再次拧紧管盖。
  3. 迅速将冻存管下半部分放在37°C水浴中解冻细胞,并在解冻过程中密切观察冻存管。
  4. 当冻存管内仅剩下少量冰时,从水浴中取出冻存管。不要让细胞完全解冻。
  5. 在无菌生物安全柜中,用70%酒精对管身消毒。
  6. 小心取下管盖。不要触碰管盖或冻存管的边缘,以避免污染。
  7. 使用2 ml移液管轻轻吹打管内细胞5次,使细胞重悬。小心不要吹打过猛,以免产生泡沫。
  8. 用移液管从冻存管中取出细胞悬液(1ml)并轻轻转移至装有15 ml人前脂肪细胞生长培养基811-500)的T-75培养瓶 (SIAL0641)中。
  9. 盖上培养瓶盖并轻轻摇动,使细胞均匀分布。
  10. T-75培养瓶 (SIAL0641)放在37oC、5% CO2恒湿培养箱中。松开瓶盖,以便气体交换。为获得最佳结果,在接种后24小时内不要挪动培养物。
  11. 接种24小时后或过夜后,更换新鲜的人前脂肪细胞生长培养基811-500),以去除所有残留的DMSO。
  12. 每隔一天更换一次人前脂肪细胞生长培养基811-500),直至细胞达到60%融合。
  13. 当培养细胞融合率达到60%以上或周末无换液培养时,将人前脂肪细胞生长培养基811-500)用量加倍。
  14. 当HPAd达到85-95%融合时,进行细胞传代。

IV. HPAd传代培养

A. 准备传代试剂

  1. 从-20°C冰箱中取出胰蛋白酶/EDTA溶液T3924)和胰蛋白酶抑制剂溶液T6414),置于4°C冰箱中解冻过夜。
  2. 确保所有传代试剂均解冻。将每个瓶子轻轻摇动几次,使溶液混合均匀。
  3. 将所有传代试剂放在4°C,供后续使用。
  4. 分装胰蛋白酶/EDTA溶液T3924)。如果只需要使用一部分胰蛋白酶/EDTA溶液T3924),则将未使用部分保存在-20°C。

B.准备培养瓶

1.从冰箱中取出人前脂肪细胞生长培养基811-500)。在无菌超净台中使用70%酒精对瓶身进行消毒。

2.吸取35 ml人前脂肪细胞生长培养基811-500)置于 T-175培养瓶(SIAL1080)中(用于第IV C部分第15步)。

C. HPAd传代培养

在室温下用胰蛋白酶消化细胞。不要将任何试剂预热至37°C。

1. 吸出培养瓶中的培养基。

2. 使用HBSS (H6648)清洗单层细胞,并吸出溶液。

3. 取6 ml胰蛋白酶/EDTA溶液T3924)置于T-75培养瓶 (SIAL0641)中。轻摇培养瓶,使溶液覆盖所有细胞。

4. 立即取出5 ml溶液。

5. 将瓶盖拧紧,并在室温下使用倒置显微镜观察胰酶消化过程。细胞通常需要1-3分钟才能变圆。细胞在胰酶消化过程中可能不会完全变圆,并且有些细胞可能会在脱离培养表面后依然处于消化进程中。

6. 用培养瓶一侧撞击手掌,使变圆的细胞从培养表面脱落,直至大多数细胞脱落下来。

7. 向培养瓶中加入5 ml胰蛋白酶抑制剂溶液T6414),以抑制进一步的胰酶消化活性。

8. 将培养瓶中的细胞悬液转移至50ml无菌锥形管中。

9. 再次向培养瓶中加入5 ml胰蛋白酶抑制剂溶液T6414)进行清洗,并将溶液转移至相同的锥形管中。

10. 在显微镜下检查T-75培养瓶 (SIAL0641)。如果有20%以上的细胞残留在瓶内,则重复步骤2-9。

11. 将锥形管以220 x g离心5分钟,使细胞沉淀。

12. 吸出管内上清液,不要破坏细胞沉淀。

13. 用手指轻弹锥形管的尖端,使细胞团块松散开。

14. 用移液管轻轻吹打细胞以分散细胞团块,使细胞重悬于5 ml人前脂肪细胞生长培养基811-500)中。

15. 使用血细胞计数板或细胞计数仪计数细胞。若需要细胞快速生长,则以10,000个细胞/ cm2 的密度接种细胞;若需要常规传代,则以6,000个细胞/ cm2 的密度接种细胞。

 

V.  HPAd分化

A. 用于分化的HPAd接种

1. 根据下表所述,调整人前脂肪细胞生长培养基811-500)体积,使细胞溶液达到目标细胞密度。
 

培养板规格 表面积/孔 细胞密度(个细胞/ml) 体积/孔 细胞数/孔 体积/板
6 孔板 9.40 cm2 110,000 4 ml 440,000 24 ml
12 孔板 3.83 cm2 90,000 2 ml 180,000 24 ml
24 孔板 1.88 cm2 90,000 1 ml 90,000 24 ml
48 孔板 0.86 cm2 84,000 500 µl 42,000 24 ml
96 孔板 0.32 cm2 110,000 150 µl  16,500 14.4 ml
T-25 培养瓶 25 cm2 240,000 5 ml 1,200,000 5 ml
T-75 培养瓶 75 cm2 240,000 15 ml 3,600,000 15 ml


2. 将前脂肪细胞以44,000个细胞/cm2的密度接种至所需培养板中,使细胞分化。

3. 将细胞置于37oC、5% CO2恒湿培养箱中培养。

4. 当细胞达到100%融合且细胞铺满培养表面时,开始分化。细胞通常需要1-2天才能达到完全融合。


B. 准备分化培养基

  1. 从冰箱中取出人脂肪细胞分化培养基811D-250)。在无菌超净台内使用70%酒精对培养基瓶消毒。
  2. 取出所需体积的人脂肪细胞分化培养基811D-250)并分装,松开分装瓶盖并在37 oC、5% CO2恒湿培养箱中平衡2小时,以便气体交换并使培养基预热至37°C。

 

C. HPAd分化为HAd

在更换培养基时,避免细胞干燥。

HPAd必须达到100%融合且铺满培养表面,才能开始分化。

  1. 从培养瓶中吸出生长培养基。
  2. 根据第V.A.部分第1步所述,加入合适体积的人脂肪细胞分化培养基811D-250)。
  3. 将加入人脂肪细胞分化培养基811D-250)的细胞置于37 oC、5% CO2恒湿培养箱中培养。
  4. 每3天更换一次新鲜的人脂肪细胞分化培养基811D-250),共培养15天。
  5. 在第15天结束时,细胞分化成含有脂肪滴的HAd细胞。
  6. 在检测前,取出人脂肪细胞分化培养基811D-250),然后加入人脂肪细胞饥饿处理培养基811S-250)进行饥饿培养1天。

材料