人体骨骼肌细胞(HSkMC)培养方案


 I. 储存

A. 冻存管 (150-05a150-05fS150-05aS150-05f)

收到后立即将冻存管保存在液氮储存罐中。

*从液氮储存罐中取出冻存管时,务必佩戴防护面罩和手套。从液氮罐到房间的剧烈温度变化可能会导致冻存管中滞留的液氮爆炸并造成伤害。

150-05a 细胞

人体骨骼肌细胞(HSkMC)


 II. 细胞培养准备工作

  1. 确保具有HEPA过滤层流的II级生物安全柜处于良好的工作状态。
  2. 使用70%酒精对生物安全柜进行消毒。
  3. 开始细胞培养工作之前,提前10分钟打开生物安全柜吹风机。
  4. 确保所有血清学移液器、移液管和试剂溶液无菌。
  5. 遵守标准无菌技术和安全规则:
    a.    不要用嘴吸移液管。
    b.    在处理人类细胞时始终佩戴手套和护目镜,即使所有菌株均已经过测试为HIV、乙肝和丙肝病毒阴性。
    c.    在无菌超净台内处理所有细胞培养工作。


 III. 培养HSkMC

A. 为 HSkMC培养准备细胞培养瓶

  1. 从冰箱中取出骨骼肌细胞培养基 (151-500)。在无菌超净台中使用70%酒精对瓶身进行消毒。
  2. 移取15ml 骨骼肌细胞培养基 (151-500)* 至T-75 培养瓶中 (SIAL0641)。
    *保持培养基与表面积的比例为1ml:5 cm2.
    例如:
    - 一个T-25培养瓶 (SIAL0639)或一个 60 mm组织培养皿 (SIAL0166)使用5ml培养基。
    - 一个 T-75培养瓶 (SIAL0641)或一个100 mm组织培养皿 (SIAL0167)使用15ml培养基。

B. 解冻和接种HSkMC

  1. 佩戴合适的护目镜和手套,从液氮罐中取出HSkMC冻存管。
  2. 将管盖旋开四分之一周,将可能滞留在管盖螺纹处的液氮释放出来,然后再次拧紧管盖。
  3. 迅速将冻存管下半部分放在37°C水浴中解冻细胞,并在解冻过程中密切观察冻存管。
  4. 当冻存管内仅剩下少量冰时,从水浴中取出冻存管。不要让细胞完全解冻。
  5. 在无菌生物安全柜中,用70%酒精对管身消毒。
  6. 小心取下管盖。不要触碰管盖或冻存管的边缘,以避免污染。
  7. 使用2 ml移液管轻轻吹打管内细胞5次,使细胞重悬。小心不要吹打过猛,以免产生泡沫。
  8. 用移液管从冻存管中取出细胞悬液(1ml),转移至含有15 ml骨骼肌细胞T-75培养瓶中。
  9. 盖上培养瓶盖并轻轻摇动,使细胞均匀分布。
  10. 将 T-75 培养瓶 (SIAL0641) 置于37oC、5% CO2恒湿培养箱中。松开瓶盖,以便气体交换。为获得最佳结果,在接种后24小时内不要挪动培养物。
  11. 24小时后或过夜后,更换新鲜的 骨骼肌细胞培养基 (151-500)以去除残留的DMSO。
  12. 每隔一天更换骨骼肌细胞培养基 (151-500),直至细胞达到60%融合。
  13. 当培养细胞融合率达到60%以上或周末无换液培养时,将骨骼肌细胞培养基 (151-500)用量加倍。
  14. 当HPAd培养达到85-95%融合时,进行细胞传代培养。


 IV. HSkMC的传代培养

A. 准备传代试剂

  1. 从-20°C冰箱中取出 胰蛋白酶-EDTA溶液 (T3924) 和胰蛋白酶抑制剂 (T6414),置于4°C冰箱中解冻过夜。
  2. .确保所有传代试剂均解冻。将每个瓶子轻轻摇动几次,使溶液混合均匀。
  3. 将所有传代试剂放在4°C,供后续使用。
  4. 分装胰蛋白酶/EDTA溶液 (T3924) 。如果只需要使用一部分胰蛋白酶/EDTA溶液 (T3924),则将未使用部分保存在-20°C。

B. 准备培养瓶

  1. 从冰箱中取出骨骼肌细胞培养基 (151-500)。在无菌超净台中使用70%酒精对瓶身进行消毒。
  2. 移取35 ml 骨骼肌细胞培养基 (151-500)* 至T-175 培养瓶中 (SIAL1080)(将用于第IV C 第15步。)

C. HSkMC的传代培养

在室温下用胰蛋白酶消化细胞。不要将任何试剂预热至37°C。

  1. 吸出培养瓶中的培养基。
  2. 使用HBSS (H6648)清洗单层细胞,并吸出溶液。
  3. 移取 5 ml胰蛋白酶/EDTA 溶液 (T3924) 至 T-75 培养瓶 (SIAL0641)。轻摇培养瓶,使溶液覆盖所有细胞。
  4. 立即取出4 ml溶液。
  5. 将瓶盖拧紧,并在室温下使用倒置显微镜观察胰酶消化过程。细胞通常需要2至5分钟才能变圆。细胞在胰酶消化过程中可能不会完全变圆,并且有些细胞可能会在脱离培养表面后依然处于消化进程中。
  6. 用培养瓶一侧撞击手掌,使变圆的细胞从培养表面脱落,直至大多数细胞脱落下来。
  7. 向培养瓶中加入5 ml胰蛋白酶抑制剂溶液 (T6414),以抑制进一步的胰酶消化活性。
  8. 将培养瓶中的细胞悬液转移至50ml无菌锥形管中。
  9. 再次向培养瓶中加入5 ml 胰蛋白酶抑制剂溶液(T6414)进行清洗,并将溶液转移至相同的锥形管中。
  10. 在显微镜下检查 T-75 培养瓶 (SIAL0641) 。如果有20%以上的细胞残留在瓶内,则重复步骤2-9。
  11. 将锥形管以220 x g离心5分钟,使细胞沉淀。
  12. 吸出管内上清液,不要破坏细胞沉淀。
  13. 用手指轻弹锥形管的尖端,使细胞团块松散开。
  14. 用移液管轻轻吹打细胞以分散细胞团块,使细胞重悬于5 ml骨骼肌细胞培养基 (151-500)中。
  15. 使用细胞计数板或细胞计数仪计数细胞。若需要细胞快速生长,则以10,000细胞/ cm2的密度接种细胞;若需要常规传代,则以5,000细胞/ cm2的密度接种细胞。


 V. HSkMC分化

A. 准备细胞培养皿

  1. 将 胶原蛋白包被溶液 (125-50) 轻轻旋转几次,将溶液混合均匀。
  2. 在无菌超净台中使用70%酒精对瓶身进行消毒。
  3. 为实验确定合适的HSkMC培养模式,如平皿或培养瓶。
  4. 将 胶原蛋白包被液 (125-50) 加入组织培养皿中,浓度为1ml每10cm2培养皿表面积,于37oC培养两小时或室温过夜培养。
  5. 在无菌超净台中,吸出胶原蛋白包被溶液 (125-50)。
  6. 采用 杜氏磷酸缓冲液 (D8537)清洗胶原蛋白包被表面两次。
  7. 包被培养瓶可立即使用或置于4°C保存最长两周。

B.用于分化的HSkMC接种

  1. 成人HSkMC的接种方法为32000每cm2,胎儿HSkMC的接种方法为20000每cm2,采用骨骼肌细胞培养基 (151-500)。
  2. 将细胞置于37oC, 5% CO2 湿度培养箱中过夜培养,第二天进行诱导分化。

C. 分化HSkMC为肌管

  1. 将用于分化的所需量的 骨骼肌细胞分化培养基 (151D-250) 于37oC, 5% CO2 湿度培养箱中预平衡2小时。
  2. 从培养皿中吸走 骨骼肌细胞培养基 (151-500) 。在更换培养基时不要让细胞变干。
  3. 加入适量体积的骨骼肌细胞分化培养基 (151D-250), 以1ml每5cm2比例。
  4. 将细胞置于骨骼肌细胞分化培养基 (151D-250)于37oC, 在5% CO2湿度培养箱中培养。
  5. 隔天更换新鲜的骨骼肌细胞分化培养基 (151D-250)。
  6. 多核肌管通常在3-4天内形成胎儿HSkMC,成人HSkMC在6-7天形成。


 材料