Prestige Antibody® 免疫荧光检测步骤

ICC-IF实验方案

下述实验方案采用Prestige Antibodies®进行免疫细胞化学(ICC) -免疫荧光(IF)亚细胞定位研究。除一抗外,每一张图片中还采用了一组参照标记:针对微管的抗体标志物以及核染料DAPI。

样品制备

所有洗涤都在室温下进行。

1. 使用纤维连接蛋白(12.5 ug/ml浓度)对适用于细胞培养及高分辨率荧光成像的多孔玻璃底平板室温包被1小时。

2. 进行细胞接种(每孔10,000-25,000细胞)并在带有5.0% CO2的37°C湿润空气环境下培养20-24小时。

免疫染色

3. 去除生长培养基并用PBS(8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.2) 洗涤细胞。

4. 用在PBS中制备的4%多聚甲醛固定细胞15 min。

5. 用0.1% Triton X-100 PBS溶液对细胞通透处理10 min。

6. 用PBS洗涤细胞一次并在封闭缓冲液中(4% FBS的PBS溶液)室温孵育1 h以封闭非特异性位点。

7. 在封闭液中将细胞用一抗4°C孵育过夜。

8. 第一天用PBS洗涤细胞4x10 min并在封闭液中用二抗室温孵育1.5 h。

注:二抗是通过荧光标记的,因而具有光敏感性.。样品保存及后续操作必须保持弱光条件。

9. 细胞用ug/ml核染料DAPI 1PBS溶液中复染5 min。

10. 细胞用PBS洗涤4x10 min并在含有0,02 % (w/v) NaN3的PBS中封固。

 

一抗:

  • 一抗,工作浓度1-4 ug/ml。
    :一抗稀释比例仅作参考。最佳的稀释比例须由用户自行确定。
  • 小鼠抗α-微管蛋白单抗(T9026),稀释500x用于多克隆抗体。
  • 小鼠抗α-微管蛋白单抗克隆DMI1A (T9026),用于单克隆抗体。

二抗:

抗兔IgG和抗小鼠IgG荧光染料偶联的二抗。

2017年十月修改

 

 

 

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