Prestige Antibody®免疫组化操作步骤

 IHC实验方案

建议按照下述标准IHC染色方案来使用专为免疫组化表达谱分析而开发的Prestige Antibodies®

 

 脱蜡

将4μm厚的石蜡切片在50℃下烘烤过夜。在免疫染色之前,在二甲苯和分级乙醇至水中进行脱蜡和水合。在水合期间,在含0.3%H2O2的95%乙醇中进行5分钟的内源性过氧化物酶阻断。

 

 标准抗原修复方法

标准的抗原修复方法是在pH6的修复缓冲液中采用加压锅炉(Decloaking chamber, Biocare Medical, Walnut Creek, CA, USA)作为热源进行热介导的表位修复(HIER),采用加压锅炉(Decloaking chamber, Biocare Medical, Walnut Creek, CA, USA)

HIER通过将浸入修复缓冲中的TMA切片在加热锅炉中125°C条件加热4分钟而完成。经过完全的加热后,切片仍保留在加热锅炉中并让其冷却至90°C

注:一抗的特定工作稀释度仅作为建议。最佳稀释度必须由用户确定。

 

免疫组化染色程序Autostainer 480®

所有的孵育均在室温下进行。

所有的试剂均按每张切片300 ul体积加入。

1. 在洗涤缓冲液中进行润洗。

2. 用Ultra V Block模块孵育5分钟。

3. 在洗涤缓冲液中进行润洗(x2)。

4.  用一抗孵育30分钟。

5.  在洗涤缓冲液中进行润洗(x3)。

6.  用一抗增强液孵育20分钟。

7.  在洗涤缓冲液中进行润洗(x2)。

8.  用标记的聚合物孵育30分钟。

9.  在洗涤缓冲液中进行润洗(x2)。

10. 在DAB溶液中显色5分钟。

11. 用蒸馏水润洗。

12. 苏木精中对比染色5分钟。**

13. 自来水润洗5分钟。**

14. 用将饱和溶液按1:5比例稀释的碳酸锂水进行润洗1分钟。**

15. 用自来水润洗5分钟。**

16. 在分级乙醇和二甲苯中进行脱水。**

17.  盖片。

* 对于多克隆抗体可免去第6和7步。

** 第14-16步是在组织染色仪器(Leica Autostainer XL)中进行的。

 

试剂

  • 洗涤缓冲液(10倍浓缩液)。工作溶液最初含有0.05%(v / v)Tween 20。加入更多Tween 20至终浓度为0.20%
  • 修复液: Citrate buffer®, pH 6.
  • 抗体稀释液
  • 苏木精
  • 二甲苯

 

其他抗原修复方法

对于特定的抗体,可按照产品数据表中所述采用其他修复缓冲液或基于酶的抗原修复方法。

 

酶促抗原修复

酶法修复是在免疫染色仪器中进行的,通过在室温条件下将TMA切片在蛋白酶K中孵育10分钟。

 

在pH 9修复缓冲液中进行的热介导表位修复(Hier)

在pH 9修复缓冲液中进行的HIER按标准HIER方法进行,只是其中的修复缓冲液pH为9而非6。

2017年10月修改

 

 

©2015 Sigma-Aldrich Co. LLC. All rights reserved. SAFC and SIGMA-ALDRICH are trademarks of Sigma-Aldrich Co. LLC, registered in the US and other countries. Prestige Antibodies is a registered trademark of Sigma-Aldrich Co. LLC. Sigma-Aldrich and SAFC brand products are sold by affiliated Sigma-Aldrich distributors. Purchaser must determine the suitability of the product(s) for their particular use. Additional terms and conditions may apply. Please see product information on the Sigma-Aldrich website at www.sigmaaldrich.com and/or on the reverse side of the invoice or packing slip.