KiCqStart™通用SYBR® Green qPCR实验方案

 

背景

KiCqStart SYBR Green qPCR ReadyMix是2X浓缩的即用型反应混合物,含有除引物和模板外的实时定量PCR (qPCR)所有组分。这种专有缓冲液、稳定剂和KiCqStart Taq DNA聚合酶的独特组合使用SYBR Green qPCR的快速或常规循环方案,提供最高的PCR效率、灵敏度、特异性和稳定的荧光信号。

高特异性扩增对于使用SYBR Green I染料技术成功进行qPCR至关重要,因为该染料可结合扩增过程中产生的任何dsDNA并进行检测。KiCqStart Taq DNA聚合酶含有专有的单克隆抗体混合物,可与聚合酶结合并在PCR预变性步骤之前保持其无活性(室温下>48小时)。酶的活化在95 °C下瞬时完成。60 °C下,在不到20秒的时间内即可完成高达200 bp的片段复制。

详情请参阅qPCR技术指南基于SYBR Green I的qPCR技术动画

 

KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™的仪器兼容性

不同的实时PCR系统采用不同策略来校准荧光信号和校正孔间光学变化。为特定仪器匹配合适的qPCR试剂至关重要。KiCqStart SYBR Green qPCR ReadyMix不含内参染料。请查阅下表或访问我们的网站www.sigmaaldrich.com寻找适合您仪器平台的最佳试剂盒。

 

KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 兼容的仪器
KCQS00 Bio-Rad CFX384™, Bio-Rad CFX96™, Bio-Rad MiniOpticon™, Bio-Rad/MJ Chromo4™, Bio-Rad/MJ Opticon 2, Bio-Rad/MJ Opticon®, Cepheid SmartCycler®, Eppendorf Mastercycler® ep realplex, Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s, Illumina Eco qPCR, Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000, Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000, Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q, Roche LightCycler™ 480
KCQS01 Applied Biosystems 7500, Applied Biosystems 7500 Fast, Applied Biosystems ViiA 7, Stratagene Mx3000P®, Stratagene Mx3005P™, Stratagene Mx4000™
KCQS02 Applied Biosystems 5700, Applied Biosystems 7000, Applied Biosystems 7300, Applied Biosystems 7700, Applied Biosystems 7900, Applied Biosystems 7900 HT Fast, Applied Biosystems 7900HT, Applied Biosystems StepOnePlus™, Applied Biosystems StepOne™
KCQS03 BioRad iCycler iQ™, BioRad iQ™5, BioRad MyiQ™

 

耗材

 

检测指南

  • 引物设计:
    • 预先设计的引物:Sigma提供了一组预先设计的引物,这些引物已经过优化,可与KiCqStart SYBR Readymix一起使用。这些KiCqStart引物可以货号 KSPQ12012订购。
    • 定制引物:
      • 高特异性引物的设计是使用SYBR Green I染料成功进行实时PCR最重要的参数。鼓励使用计算机辅助引物设计程序,以使每个引物和引物对内3'末端内部二级结构和互补的可能性最小化。定制底物可通过货号OLIGO订购。
    • 扩增子大小:KiCqStart SYBR Green qPCR ReadyMix可以很容易地扩增400到500 bp的片段;但是,要充分利用快速循环方案,扩增子大小应限制在150 bp以下。
    • 引物浓度:最佳结果可能要求引物滴定浓度为100至500 nM。300 nM的引物终浓度为对绝大多数反应有效。
  • 反应构建:
    • 建议制备反应混合物以减少移液误差并使分析精度最大化。将反应混合物与除样品模板(基因组DNA或cDNA)之外的所有所需组分混合,然后将等分试样分配到独立的反应管中。最后一步,将DNA模板添加到每个反应中。对模板样品进行稀释,至少添加5 µL,这样可提高检测精度。
    • 推荐的模板起始量:对应于总RNA为1pg至100ng的cDNA;100 pg至100 ng基因组DNA
 

反应构建

试剂 20 μL反应的用量 终浓度
KiCqStart SYBR Green qPCR ReadyMix (2X) 10.0 µL 1X
正向引物 可变 100 - 500 nM(从300 nM开始)
反向引物 可变 100 - 500 nM(从300 nM开始)
无核酸酶水(W1754) 可变 添加到适量至20 µL
模板 至少5 μL 可变
最终体积 (µL) 20 μL  

最终反应体积在10到50 μL之间,可按比例改变所有组分的量。

对各反应密封后,轻轻涡旋混合内容物。短暂离心,收集反应管底部的组分。

 

PCR 循环方案

  快速2步循环 快速3步循环 标准循环
预变性: 95 °C, 30 sec * 95 °C, 30 sec * 95 °C, 2-3 min *
PCR循环(30-45个循环): 95 °C, 3-5 sec 95 °C, 3-5 sec 95 °C, 10-15 sec
    55 to 65 ºC, 15 sec  
在扩增步骤结束时收集数据 60 °C, 20-30 sec  68 to 72 °C, 10 sec  60 °C, 30-60 sec 
熔解曲线 参阅仪器说明(可选)

95 ºC下,KiCqStart Taq DNA聚合酶可在1秒内完全激活;但是,最佳预变性时间依赖于模板,并且将影响qPCR的效率和灵敏度。扩增基因组DNA或超螺旋质粒DNA靶标在95 ºC下可能需要5到10分钟才能使模板完全变性并解链。短链双链DNA模板(PCR产物)或单链DNA模板在95 ºC下可能只需要1秒。95 ºC下,使用30秒作为通用起点。

† 延长时间取决于扩增子长度和qPCR仪器的最小数据收集时间要求。一些引物组获得最佳性能需要执行3步循环方案。对于给定的引物组和实时仪器,需要凭经验确定最佳退火温度和时间或引物浓度。

 

材料

     

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc., KiCqStart is a trademark of Quanta BioSciences, TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc.  LightCycler is a registered Trademark of Roche. Applied Biosystems, StepOne, StepOnePlus, ViiA, and ROX are trademarks Life Technologies Corporation. Stratagene, MX3000P, MX3005P and MX4000 are trademarks of Agilent Technologies, Inc. Mastercycler is a trademark of Eppendorf. Rotor-Gene is a registered trademark of Qiagen GmbH.  SmartCycler is a trademark of Cepheid. CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, Opticon, MiniOpticon and Chromo4 are trademarks of Bio-Rad Laboratories. SYBR is a registered Trademark of Molecular Probes, Inc.

Refer to product technical bulletin for product licensing information.