慢病毒转导实验方案

下列实验方案用于96孔板中的高含量筛选。

 

 材料

  • MISSION® shRNA慢病毒转导颗粒
  • 溴化己二甲铵(产品编号:H9268)
  • MISSION pLKO.1-puro对照转导颗粒(产品编号:SHC001V
  • MISSION shRNA非靶向对照转导颗粒(产品编号:SHC002V
  • MISSION TurboGFP对照转导颗粒(产品编号:SHC003V
  • 最低必需培养基(MEM)含有10%胎牛血清或针对特定细胞系优化的生长培养基
  • 96孔细胞培养板
  • 要转导的哺乳动物细胞
 

 准备

准备哺乳动物细胞,使它们呈指数增长,并在转导前不超过70-80%汇合。

在水中制备2 mg/ml溴化己二甲铵的原液。

 

 方法

第1天

将新鲜培养基中的1.6×104个细胞添加至96孔板中每种结构所需的孔数。要使用的每种慢病毒结构和对照需一式两份或三份。
在37℃、5-7% CO2的加湿培养箱中孵育18-20小时。

说明:细胞的生长速度差异很大。调节接种的细胞数,以在转导时达到70%的汇合。另外,在确定接种密度时,还需考虑下游分析之前细胞生长的时间长度。

第2天

从培养孔中移除培养基。向每个孔加入110 μL培养基和溴化己二甲铵至终浓度为8 μg/ml。轻轻转动培养板以便混合。

说明:溴化己二甲铵可增强大多数细胞类型的转导。一些细胞,如原代神经元,对溴化己二甲铵敏感。请勿在这些类型的细胞中加入溴化己二甲铵。如果是第一次使用某种类型的细胞,则应使用一个仅含己二甲胺的对照培养孔来确定细胞敏感性。

向适当的孔中加入2-15 μL慢病毒颗粒。轻轻转动培养板以便混合。在37℃、5-7%CO2的加湿培养箱中孵育18-20小时。细胞培养4小时,即可更换含有慢病毒颗粒的培养基。如果关注慢病毒颗粒的毒性,则应避免过夜孵育。

说明:首次将慢病毒结构转导入细胞系时,应测试一系列体积或MOI。应该使用每1.6 x 104细胞2、5、10和15 µL慢病毒颗粒或者1、2和5的MOI,来确定每种细胞系的最佳转导效率和敲减(见附录)。在用shRNA结构测定之前,使用MISSION TurboGFP对照转导颗粒可以优化转导效率。

 

MOI 慢病毒滴度(TU/mL)
106 107 108
0.5 35 3.5 0.35
1 不适用 7 0.7
2 不适用 14 1.4
5 不适用 35 3.5

表1:取决于病毒滴度,添加到96孔板每个孔中的体积(μL)。该表假设每孔约70,000个细胞。慢病毒滴度可以在每个病毒批次的分析证书上找到。

第3天

从孔中除去含有慢病毒颗粒的培养基。每孔加入新鲜培养基至120 μL的体积。

说明:对于不牢固粘附在培养板上的细胞类型,可以去除100 μL培养基,并用100 μL新鲜培养基替换。

第4天及以后

每3-4天更换一次培养基,直到细胞测定。

可以选择细胞,并且可以扩增每个克隆,以测定shRNA的表达。

可以进行多种表型、酶或基因表达测定。在具有阴性和阳性两种对照的高含量筛选之前,应优化所需的测定。

说明:由于慢病毒随机整合到宿主基因组中,因此可能会在不同的菌落中观察到不同水平的TurboGFP表达或shRNA表达。测试多个菌落有助于确定最佳表达程度。


 附录

感染的多重性(MOI):感染的多重性是指每个细胞的转导慢病毒颗粒的数量。强烈建议对于要转导的每种新细胞类型,测试一系列MOI。这将能确定所用的每种细胞系的有效转导所需的最佳慢病毒上清液量。

计算:

(每孔的细胞总数)x(所需的MOI)= 所需的总转导单位(TU)

(所需的总TU)/(在A的C上报告的TU/ml)= 每孔加入的慢病毒颗粒的总ml

 

 参考文献

Cold Spring Harbor Protocols

Lentivirus Transduction of Hematopoietic Cells

Ming-Jie Li and John J. Rossi
Division of Molecular Biology, Beckman Research Institute of the City of Hope, Duarte, California 91010

 

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MISSION是Sigma-Aldrich Co. LLC标签许可的注册商标。 TurboGFP是Evrogen的商标。

 

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