LPL活性检测实验方案

Roar Biomedical, Inc所提供

货号 MAK109
储存温度: 2–8 °C

 

 组分

该试剂盒可供100次总反应体积为200 µL的检测使用。

底物乳液                                                  0.125 mL
货号 MAK109A

LPL 标准品, 75.7 mM                                 0.1 mL
货号 MAK109B

LPL 检测缓冲液                                         20 mL
货号 MAK109C

 

所需试剂(自备)

  • 用于荧光检测的96孔U型底黑色平板
  • 37 °C水浴锅
  • 荧光多孔板酶标仪
  • 用于检测验证的Orlistat (货号O4139)

 

注意事项及免责声明

本品仅供研发使用,不适用于药物、家用或其他用途。有关危险和安全处理方法的信息,请参阅安全数据表。

 

准备说明

打开前,先将试剂管短暂离心。

底物乳液 – 使用前请先涡旋混匀。

 

储存/稳定性

该试剂盒采用湿冰运输。建议在2–8 °C环境中避光保存。不可冷冻。

如果保存适当,试剂盒组分可稳定保存1年。

 

操作步骤

所有样品和标准品应重复检测2次。

荧光检测标准品

注:标准品不可与样品一起孵育,请使用独立的平板进行标准品检测。

1.  取1 uL的LPL标准品加入至2.5 mL的LPL检测缓冲液以制备30.3 uM的标准品溶液。通过8-12次额外的2倍梯度稀释(使用至少0.1 mL的前一次标准品溶液以及0.1 mL的LPL检测缓冲液),制备具有不断降低的LPL浓度的标准品。 
2.  将每种稀释液取0.2 mL加入至可兼容荧光检测的微孔板中并对荧光强度(λex = 370/λem = 450 nm)进行测量。0.2 mL的LPL检测缓冲液作为 0(空白)标准品(参考表1)。
 
表1
标准品的样品荧光读数

nmoles/ 0.2 ml
标准品重复的平局值(FIU) 平均FIU减去0(空白)标准品 
6.06
240,407
240370
3.03
133,697
133660
1.515
67,513
67476
0.758
33,385
33347
0.379
17,221
17184
0.189
8,669
8631
0.095
4,351
4314
0.047
2,180
2142
0.024
1,123
1086
0.012
556
518
0.006
286
248
0(空白) 标准品 37.50
0

 
3.    绘制标准曲线(FIU与标签的纳摩尔数)并确定斜率(m)和截距(b)。可采用该标准曲线根据荧光强度单位计算参与反应的底物纳摩尔数。
 

样品制备
1.    根据表2中的方案设置主反应混合液。向单次反应体系(孔)中加入195 mL的主反应混合液。

表 2.
主反应混合液

Reagent 反应体积
LPL 检测缓冲液
194 µL
LPL 底物乳液
1 µL


注:底物处于液晶状态并且难以对小体积进行精确地移液。建议使用较宽的移液吸头或剪去标准移液吸头的末端来进行底物移液。

2.    向相应的孔中加入5 uL的待测LPL来源(新鲜或冷冻的血浆或血清)。可加入5 ul的LPL检测缓冲液来替代LPL来源作为样品空白对照。

注:对于未知样品,推荐检测多个稀释度的样品以确保读值落在标准曲线的线性范围内。 

在检测过程中LPL的用量和孵育温度将取决于蛋白的比活性。例如,具有高比活性的LPL纯化样品可能需要用LPL检测缓冲液稀释并在25℃进行孵育以实现线性的响应。建议首次使用的用户采用较低的温度以及约15分钟的孵育时间点,以及多次读数以确定出一组优化的条件。



检测反应


1.   将平板进行密封并在25–37 °C孵育15-60分钟。
 
2.   用荧光计(λex = 370/λem = 450 nm)测量样品荧光的增强。通过减去空白对照的荧光值来确定每个血清或血浆样品的荧光强度。
 
3.   通过用(y)减去截距(b)并除以标准曲线的斜率(m)来计算标签的纳摩尔数。



检测验证操作步骤

该过程是根据一种已发表的方法,采用Orlistat (货号O4139)——也称为四氢利巴韦汀(THL)——对LPL活性进行抑制以对检测进行验证

注:硫酸铵悬浮液形式的LPL(如产品货号L2254)不能被orlistat所抑制。不含硫酸铵的其他来源LPL,包括细菌LPL(货号62335)可很好地验证抑制剂检测。


1.    细菌LPL(货号62335,3.3 mg/mL)溶解于10 mM Tris HCL、pH 8.5,并加入4 mM的脱氧胆酸钠(货号30970)以及0.1 mM的亚油酸(货号L1376),具有以下不同的浓度 。
2.    加入溶解于DMSO(货号W387509)中的Orlistat,使得终浓度为16.8、3.36、0.67、0.13、0.027及0 µM。
3.    在20 °C孵育10分钟后,吸去10 uL体积并根据检测过程对活性进行测定。

MAK109-image-X-Roar-LPL-Activity-Assay-inhibition-with-Orlistat-Sheet1


图1

Orlistat与LPL活性检测抑制的关系

 

材料