MTP活性检测试剂盒实验方案

由Roar Biomedical公司提供

货号: MAK110
储存温度:2-8 °C

 

组分

该试剂盒可供100次总反应体积为200 µL的检测使用。

供体颗粒                                0.4 mL
    货号 MAK110A

受体颗粒                                0.4 mL
    货号 MAK110B

MTP 检测缓冲液                     20 mL
    货号 MAK110C

 

所需试剂(自备)

  • 需要自备的试剂和仪器
  • 96孔U形底黑色荧光检测板,带有粘性封板膜
  • 37 °C水浴锅
  • 荧光多孔板酶标仪
  • 光谱纯异丙醇(货号34863
  • PMSF(货号P7626),用于HepG2细胞匀浆
  • 亮抑酶酞(货号2884),用于HepG2细胞匀浆
  • CP-346086(货号PZ0103)),用于检测验证
 

注意事项和免责声明

本品仅供研发使用,不适用于药物、家用或其他用途。有关危险和安全处理方法的信息,请参阅安全数据表。

 

准备说明

打开前,先将试剂管短暂离心。

 

储存/稳定性

该试剂盒采用湿冰运输。建议在2–8 °C环境中避光保存。不可冷冻。

如果保存适当,试剂盒组分可稳定保存1年。

 

操作步骤

所有样品和标准品应重复检测2次。

荧光检测标准品

1. 准备6个试管,分别标记为T0至T5,每管加入1 mL异丙醇并在T5中再多加1 mL异丙醇。

2. 取5 µL供体颗粒置于T5试管中,然后混匀(涡旋),使供体颗粒均匀分散于异丙醇中。

注:试剂管标签上已注明供体颗粒中荧光底物的浓度。

3. 对上一步所得溶液进行4次连续的2倍稀释(取1 mL上一步所得标准溶液置于含1mL异丙醇的试管中)。例如,从T5试管中取出1 mL混合物转移至T4中并涡旋混匀。以仅含异丙醇的T0试管作为0(空白)标准品。

注:请勿孵育标准品。

4. 测量T0至T5试管中标准品的荧光强度(λex = 465/λem = 535)。例如,从每管中取出100 µL溶液,分别置于检测板的孔中并读板。

5. 绘制每个标准品的荧光强度单位与每个标准品中供体颗粒pmole数量的关系图,创建标准曲线。绘制标准曲线(FIU与标记物的nmol数),确定斜率(m)和截距(b)。利用该标准曲线,可根据荧光强度单位计算标记物的nmol数。

 

样品制备—HepG2细胞匀浆

1. 将HepG2细胞接种于75 cm2 T培养瓶中,生长至细胞融合。

2. 准备足量的匀浆缓冲液(10 mM Tris,pH 7.4,含150 mM NaCl和1 mM EDTA)。

3. 向100 mL匀浆缓冲液中加入0.5 mL溶剂为乙醇的100 mM PMSF(货号P7626)以及2 mL溶剂为Tris-生理盐水的亮抑酶酞(货号L2884)。

4. 收集6个培养瓶的细胞并混悬于5 mL匀浆缓冲液(蛋白质浓度约为10 mg/ml)中。

5. 使用配有超声乳化针头的550 W超声仪(强度设置:4),将混悬液置于冰上超声5次,每次5秒。

6. 使用100µg蛋白质匀浆进行MTP活性检测。

注:无需将细胞碎片离心以低速4获得上清液,也无需对细胞膜进行部分纯化以检测MTP活性。

 

检测反应

1. 根据表1所述,制备反应预混液。向每个反应(孔)中加入190 µL反应预混液。

表1.

反应预混液

试剂 体积
MTP检测缓冲液

182 µL

供体颗粒

4 µL

受体颗粒

4 µL

 

2. 向相应孔中加入10 µL待测MTP样品(匀浆的HepG2细胞或部分纯化MTP)。在空白对照孔中,加入10 µL检测缓冲液代替MTP样品。

注:对于未知样品,建议检测多个样品稀释液,以确保在标准曲线的线性范围内读取荧光强度。

3. 根据MTP样品的具体活性大小,可能需要调整样品体积。对于低活性样品,应减少缓冲液体积并增加样品体积。或者,将含有样品的微孔板在25 °C环境中孵育过夜。MTP可在25 °C保留活性。

4. 将反应板密封并在37 °C孵育3-6小时。

注:微孔板温育箱必须能够将检测温度快速升至37 °C。大型恒湿空气温育箱需要3小时才能将温度从25 °C缓慢升高至34 °C,因此可能引发问题。建议将反应板漂浮在水浴上,而不要使用空气温育箱。

5.  使用荧光测量仪检测样品的荧光强度增加(λex = 465/λem = 535 nm)。用每个样本的荧光强度减去空白样本的荧光强度,确定血浆和血清样本的荧光强度。

6.用(y)值减去截距(b)再除以标准曲线的斜率(m),计算检测中标记物的pmole数值。


检测验证步骤

提取的MTP必须与CP-346086一起使用。在该流程中,MTP是从大鼠肝脏微粒体中提取出来的。

试剂准备

  • 缓冲液A—50 mL的100 mM Tris,pH 7.4,含100 mM KCl和10 mM MgCl2
  • 50 mM Tris,pH 7.4,含0.54%脱氧胆酸盐
  • 缓冲液B—100 mM Tris,pH 7.4,含1.5 M NaCl和10 mM EDTA
  • 1% BSA(含微量脂肪酸)


样品制备

注:将缓冲液和离心机转子冷却。

  1. 将大鼠肝脏微粒体(0.5 mL,总蛋白浓度 = 20 mg/mL)解冻并使用缓冲液A稀释至3.5 mg/mL,所得微粒体溶液为总蛋白浓度为3.5 mg/mL的50 mM Tris,pH 7.4,含50 mM KCl和5 mM MgCl2。例如,取1.429 mL缓冲液A并与0.929 mL水和0.5 mL微粒体混合。
  2. 加入0.1倍体积的脱氧胆酸盐溶液,同时涡旋振荡并始终放在冰上。例如,加入三份95 µL脱氧胆酸盐溶液,同时涡旋和冷却。
  3. 在冰上孵育30分钟。
  4. 以105,000 x g离心75分钟。回收上清液,弃去沉淀。
  5. 加入0.1倍体积的缓冲液B。在验证检测中,直接将该溶液与CP-346086一起使用。

 

验证反应

  • 将CP-346086溶解于DMSO至合适浓度(例如,5.5、1.11、0.55、0.111和0.011 µM)。
  • 根据表2所述,制备验证反应预混液。向每个反应(孔)中加入94 µL验证反应预混液。

表2.

验证反应预混液

试剂
体积
MTP 检测缓冲液
80 µL
供体颗粒 2 µL
受体颗粒 2 µL
1% BSA
10 µL

  • 将1 µL各浓度的CP-346086稀释液分别加入相应孔中,用移液器吹打混匀。分别加入5 µL的纯化MTP,再次用移液器吹打混匀。所得溶液的抑制剂终浓度为55、11.1、5.5、1.11和0.111 nM。
  • 在空白样品孔中,加入5 µL MTP检测缓冲液和1 µL DMSO,代替样品和CP-346086溶液。
  • 将反应板密封,并在37 °C孵育60分钟。
  • 使用荧光测量仪检测验证样品的荧光强度(λex = 465/λem = 535 nm)。
 

图1.

大鼠肝脏微粒体的MTP活性

MTP Activity in Rat Liver Microsomes
 

 

表2.

验证反应预混液

MTP Inhibition with CP-346086
 

 

材料