培养基制备 — 植物组织培养实验方案

 从原装粉末制备

粉状培养基极易吸湿,必须保护好以防大气中的水分。如果可能,打开一包后应立即全部用完。不建议以浓缩形式制备培养基,因为一些盐复合物可能会沉淀。添加到培养基中的补剂可能会影响保质期和储存条件。制备培养基的基本步骤如下:

  1. 量出组织培养级纯水(产品编号:W 3500)最终所需体积的90%左右,举例来说,如果最终体积为1000 ml,则量出900 ml。选用两倍于最终体积大小的容器。
  2. 一边搅拌水,一边添加培养基粉末,直至完全溶解。可能需要加热以使粉末溶入溶液。
  3. 用少量组织培养级纯水冲洗原始容器,以去除痕量的粉末。添加到步骤2的溶液中。
  4. 加入所需的热稳定补剂(例如蔗糖、胶凝剂、维生素、生长素、细胞分裂素等)。
  5. 添加额外的组织培养级纯水,使培养基达到最终体积。
  6. 一边搅拌,一边添加NaOH、HCl或KOH,以将培养基调节至所需pH。
  7. 如果使用了胶凝剂,则加热直至溶液澄清。
  8. 根据您的应用,在高温高压灭菌之前(或之后),将培养基分配到培养容器中。高温高压灭菌后,加入热不稳定成分。
  9. 在经过验证的杀菌釜中,以1 kg/cm2(15 psi)、121°C对培养基进行灭菌,持续时间为培养基灭菌实验方案所述时间长度。
  10. 使用前,让培养基冷却。

粉末状培养基和基础盐混合物仅供实验室使用。不适用于药物、家庭或其他用途。
 

未提供的材料

  • 组织培养级去离子水(产品编号:W3500
  • 1 N盐酸(HCl)(产品编号:H9892
  • 1 N氢氧化钠(NaOH)(产品编号:S2770
储存
将干燥培养基存放在0-5°C的干燥器中。粉末培养基的变质可以通过以下方式辨别:1)变色;2)粉末中充满颗粒和结块;3)不溶解;4)pH变化;或5)正确使用的情况下不能促进生长。
 
培养基中的沉淀
已知随着时间,植物组织培养基中会发生沉淀。已经分析了沉淀物(Sigma,未发表的数据; Dalton等,1983)。它们由浅黄色小颗粒组成。沉淀物分析结果表明,沉淀主要是铁、磷酸盐和锌。沉淀的可能原因是亚铁离子不可避免地被氧化成三价铁离子,并且存在未螯合的三价铁离子。当超过磷酸铁的溶解度时,即发生沉淀。没有报道由于沉淀物,植物组织培养物的生长和发育受到有害影响。
 

 从基础盐溶液制备

Liquid 10X溶液为您提供了方便。为了避免长期储存产生沉淀,Sigma配制了两种溶液,当以适当的稀释度混合时,即可制成具有适当盐浓度的溶液。制备1升培养基的基本步骤如下:注意:请勿将装在瓶子里的产品高温高压灭菌, 因为瓶子不可高温高压灭菌。

  1. 量出约700 ml组织培养级纯水(产品编号:W3500)。
  2. 一边搅拌水,一边加入100 ml巨量营养素溶液。
  3. 继续搅拌混合物,同时加入100 ml微量营养素溶液。
  4. 加入所需的热稳定补剂(例如蔗糖、胶凝剂、维生素、生长素、细胞分裂素等)。
  5. 添加额外的组织培养级纯水,使培养基达到最终体积。
  6. 一边搅拌,一边添加NaOH、HCl或KOH,以将培养基调节至所需pH。
  7. 如果使用了胶凝剂,则加热直至溶液澄清。
  8. 根据您的应用,在高温高压灭菌之前(或之后),将培养基分配到培养容器中。高温高压灭菌后,加入热不稳定成分。
  9. 在经过验证的杀菌釜中,以1 kg/cm2(15 psi)、121°C对培养基进行灭菌,持续时间为培养基灭菌实验方案所述时间长度。
  10. 使用前,让培养基冷却。

基础盐溶液仅供实验室使用。不适用于药物、家庭或其他用途。
 

未提供的材料

  • 组织培养级去离子水(产品编号:W3500
  • 1 N盐酸(HCl)(产品编号:H9892
  • 1 N氢氧化钠(NaOH)(产品编号:S2770
  • 所需培养基添加剂

储存
将基础盐溶液储存于0-5°C下。基础盐溶液的变质可以通过以下方式辨别:1)变色;2)pH变化;3)组分沉淀;或4)正确使用的情况下不促进生长。

 香蕉粉

产品编号:B4032

Sigma提供香蕉粉,用于兰花和其他植物细胞培养。产品编号B4032是由喷雾干燥的香蕉和糊精混合物制成的粉末。大约以40 g/L的浓度使用本品。为了减少结块,一边不断搅拌,一边将粉末缓慢加入到培养基。香蕉固体的存在,在含有这两种产品的培养基中是常见现象。
 

 椰子水

产品编号:C5915

椰子水已被证明可刺激多种植物的枝条增殖。椰子水由精选的椰子加工制成,去除了大部分蛋白质。然后将产品过滤灭菌并冷冻,最后发运。水中剩余的蛋白质水平可能每批有所不同,在产品冷冻时可能导致沉淀。该沉淀不应影响植物组织的生长。可以通过过滤除去沉淀物,亦可让沉淀物沉在瓶子底部,然后把上清液倒出来,以此除去沉淀物。根据您的标准培养基批次的大小,可以将椰子水分为较小的等分试样冷冻保存。椰子水应以5-20%(v/v)的浓度使用。
 

 材料