Cultrex® 基底膜提取物,Type 2,PathClear®实验方案

货号 3532-001-02

 

I. 产品描述

内皮细胞、上皮细胞、肌肉和神经元细胞与其相邻基质之间形成的连续的胞外基质层称为基底膜。基底膜在发育和伤口愈合时退化和再生。它们不仅支撑着细胞和细胞层,还通过影响细胞粘附、迁移、增殖和分化对组织形成产生重要作用。基底膜是转移性肿瘤细胞侵袭的主要屏障。

Cultrex®基底膜提取物(BME)是从Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 肉瘤细胞中纯化出来的一种可溶性基底膜。该提取胶在37⁰C时形成重组基底膜。BME主要组分包括:层粘连蛋白、胶原蛋白IV、巢蛋白和硫酸肝素蛋白多糖。

BME用途广泛,在不同培养条件下,可用于原代内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞和干细胞的维持性生长和促进分化。BME也可用于细胞粘附、轴突生长、血管再生、体外细胞侵袭和体内致瘤性检测等。最近,我们开发出两种新型Cultrex® BME配方——Cultrex® BME Type 2和Cultrex® BME Type 3。与我们原有的BME相比,Cultrex® BME Type 2的独特配方赋予产品更高的抗拉伸强度,而Cultrex® BME Type 3在生理学方面与体内实体瘤环境相似并被推荐用于异种移植和其他体内应用。

 

II. 规格

  1. 浓度:12 - 18 mg/ml
  2. 来源:小鼠Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)肉瘤
  3. 储存液:杜氏改良Eagle培养基,无酚红(货号D5030),加入10 μg/ml 硫酸庆大霉素(货号G1264)。

III. 注意事项和限制

  1. 仅供研究使用。不可用于诊断操作。
  2. 这些产品的物理、化学和毒理学性质尚不完全明确;因此,我们建议在处理这些化学试剂时穿戴手套、实验服和护目镜。

IV. 材料检验

  • 功能测试

血管生成试验 - BME促进人(HBMVEC;HUVEC)或小鼠(SVEC4-10)内皮细胞生成毛细管样结构

  • 无菌测试
  1. PathClear® - 共计31种生物体和病毒检测均为阴性结果,包括支原体、小鼠抗体产生(MAP)测试通常包含的17种细菌和病毒株以及包括LDEV在内的其他13种小鼠感染物。
  2. 根据USP无菌测试指南操作,在37⁰C孵育14天后,未检测到细菌和真菌生长
  3. LAL测试显示内毒素浓度≤8 EU/ml。
  • 胶凝

在37⁰C条件下,BME在30分钟内胶凝,并且可在37⁰C的培养基中保持凝胶形式至少14天。

 

Cultrex® BME 选择指南

名称 缓冲液 抗拉伸强度 浓度 用途
Cultrex® BME, PathClear DMEM 中等 12 – 18 mg/mL 异种移植/肿瘤移植,2D细胞培养,3D培养球状体/类器官,干细胞
Cultrex® BME, Type 2, PathClear® DMEM 12 – 18 mg/mL 异种移植/肿瘤移植,2D细胞培养,3D培养球状体/类器官,干细胞
Cultrex® BME, Type 3, PathClear® RPMI1640 12 – 18 mg/mL 异种移植/肿瘤移植

 

V. 储存及稳定性

本品自装运之日起,可在–20 ⁰C手动除霜冰箱中稳定保存至少3个月。保存在–80⁰C可获得最佳稳定性。避免反复冻融。

 

VI. 包被方案

将Cultrex® BME置于2-8 ⁰C解冻过夜。冰箱温度可能会发生变化;因此,在冰箱内解冻时,建议始终将BME放在冰上。当温度高于15⁰C时,解冻的BME会快速凝结;在处理提取物时,应始终将其放在冰上以避免过早胶凝。

Cultrex® BME用途广泛,不同应用需要不同的厚度和浓度。通常,蛋白浓度≥ 10 mg/ml的BME可用于原代细胞的分化研究。内部细胞形成毛细管样结构(血管形成试验)、大鼠主动脉组织分化成毛细管样结构(主动脉环微血管生成试验)、上皮类器官形成或肿瘤类器官形成等应用需要使用厚凝胶。原代细胞增殖等应用需要薄层包被而非厚凝胶,因此应使用薄层法。

 

厚凝胶法

1. 按上述方法解冻BME。

2. 用移液器轻轻吹打BME溶液,将其混匀;注意避免引入气泡。

3. 取BME溶液覆盖生长表面,用量为200-300 μl/ cm2

4. 将包被物置于37 ⁰C环境中孵育30分钟。

5. 包被物制备完成。

 

薄层法(无胶凝)

1. 按上述方法解冻BME。

2. 用移液器轻轻吹打BME溶液,将其混匀;注意避免引入气泡。

3. 使用冷藏的无血清培养基将BME稀释至目标浓度。可能需要根据经验确定最佳包被浓度。用于原代细胞增殖时,建议起始蛋白浓度为150 μg/ml。

4. 加入足量溶液,覆盖全部生长表面。建议用量为300 μl/ cm2。

5. 将包被物在室温下孵育1小时。

6. 吸出包被溶液并立即接种细胞。避免包被表面变干。

 

法律信息

Cultrex和PathClear是Trevigen, Inc.的注册商标。

 

材料

  1. Albini, A., Y. Iwamoto, H. Kleinman, G. Martin, S. Aaronson, J. Kozlowski, and R. McEwan. 1987. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47:3239-3245.
  2. Fridman, R., G. Giaccone, T. Kanemoto, G. Martin, A. Gazdar, and J. Mulshine. 1990. Reconstituted basement membrane (matrigel) and laminin can enhance the tumorigenicity and the drug resistance of small cell lung cancer cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6698-6702.
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  4. Fridman, R., T. Sweeney, M. Zain, G. Martin, and H. Kleinman. 1992. Malignant transformation of NIH-3T3 cells after subcutaneous co-injection with a reconstituted basement membrane (matrigel). Int. J. Cancer 51:740-744.
  5. Kubota, Y., H. Kleinman, G. Martin, and T. Lawley. 1988. Role of laminin and basement membrane proteins in the morphological differentiation of human endothelial cells in capillary-like structures. J. Cell Biol. 107:1589-1598.
  6. Ponce, M., M. Nomizu, M. Delgado, Y. Kuratomi, M. Hoffman, S. Powell, Y. Yamada, H. Kleinman, and K. Malinda. 1999. Identification of endothelial cell binding sites on the laminin g1 chain. Circ. Res. 84:688-694.
  7. Eisenstein, M. 2006. Thinking outside the dish. Nature Methods 3:1035-1043.
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  10. Arnaoutova IP and Kleinman HK. 2010. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocol. 5 (4); 628-35.
  11. Benton G, Kleinman HK, George J, Arnaoutova I. 2011. Multiple uses of basement membrane matrix (BME/Matrigel) in vitro and in vivo with tumor cells. Int. J. Cancer. 128 (8); 1751-7.
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