Imprint ® DNA 修饰试剂盒 (MOD50) 实验方案

产品描述

Imprint DNA修饰试剂盒可提供在不到2小时内完成亚硫酸氢盐转化和DNA样品后修饰清理所需的试剂。处理后,样品DNA可用于下游分析,例如亚硫酸氢盐测序或甲基化特异性PCR(MSP)(用于区分甲基化和未甲基化的DNA)。

DNA甲基化已被充分证明在基因表达的调节中起重要作用。在任何给定的时间内,哺乳动物基因组中都有约70%的总CpG二核苷酸被甲基化。1基因组中的低甲基化和超甲基化能够调控基因的表达。确定DNA的甲基化状态是表观遗传学研究的重要工具. 2,3

Imprint实验方案使得用户能够选择性地进行DNA修饰,其中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则保持不变。为了最佳的修饰结果,DNA量应在50-200 ng范围内,但0.1 ng至1μg的DNA也已成功使用。由Sigma Imprint DNA修饰操作步骤产生的修饰DNA适用于亚硫酸氢盐测序、MSP、焦磷酸测序和甲基化微阵列。

 

试剂盒组分 – 足够50次反应

试剂 货号 50 Rxn
DNA修饰粉末 D6943 5瓶
DNA修饰溶液 D7068 6.5 ml
平衡溶液 B5811 0.5 ml
捕获溶液 M6695 20 ml
清洗抗体 M6945 3.5 ml
洗脱溶液 M6820 1.5 ml
离心柱* S2697 各50
无盖收集管,2 ml C3368 各50
收集管,1.5 ml T3566 各50

*:在将离心柱放入微量离心机之前,始终盖上离心柱

 

存储/稳定性

所有组分均可在室温下储存。每瓶DNA修饰粉末足以进行10次DNA修饰。溶解后,溶液可在-20°C下避光保存一周。使用前,必须在室温下解冻冷冻溶液并涡旋2分钟。

 

工作流程

 

产品概况

Imprint DNA修饰试剂盒包含DNA亚硫酸氢盐转化所需的所有试剂。DNA变性和亚硫酸氢盐修饰将同时进行。在修饰过程中,亚硫酸氢盐与单链DNA发生特异性反应,使胞嘧啶脱氨基,产生尿嘧啶残基。修饰缓冲液中独特的DNA保护试剂可防止亚硫酸氢盐处理过程中DNA的化学和嗜热降解。捕获溶液可使DNA与柱滤芯紧密结合,从而有效的去除残留的亚硫酸氢钠和盐。洗脱后的修饰DNA可立即使用,或在-20°C下储存长达2个月。

 

试剂准备

  • 乙醇稀释的清洗溶液 - 向瓶中加入8.2 ml无水乙醇并混合。
  • 90%乙醇溶液 - 向4.5 ml无水乙醇中加入500μL水。
  • 平衡/乙醇清洗溶液 - 将10μL平衡溶液加入1.1 ml 90%乙醇中。
 

操作步骤

Imprint实验方案提供一步或两步法修饰步骤以供灵活选择。一步法修饰是一种更方便的实验过程,可用于更高的DNA上样量(10 ng至1μg)。建议对低DNA上样量(100 pg至10 ng)使用两步法修饰实验方法。使用稀释至0.5 mg / mL(12.5μL BSA溶于487.5μL水中)的BSA溶液(货号B8667(20 mg / mL))作为载体。BSA-水溶液可在低上样浓度下改善DNA的回收率。

 

一步法修饰操作步骤

  1. 将1.1 ml DNA修饰溶液加入1瓶DNA修饰粉末中。将小瓶涡旋2分钟或直至溶液澄清。检查小瓶中是否有任何不溶解的颗粒。如果存在颗粒,可将小瓶置于65℃下孵育2分钟并短暂涡旋。加入40μL平衡溶液并短暂涡旋。
  2. 将10μL DNA加入1.5 ml微量离心管中。将110μL步骤1的溶液加入管中,并短暂地涡旋。将管在99℃孵育6分钟。
  3. 步骤2中孵育后,立即在65℃条件下孵育90分钟,随后进行修饰后DNA清洗。


两步法修饰操作步骤

  1. 将DNA样品加入1.5 ml微量离心管中,用水或制备的0.5 mg / mL BSA-水溶液将总体积调节至24μL。加入1μL平衡溶液。涡旋并在37℃下孵育样品10分钟。
  2. 将1.1 ml DNA修饰溶液加入1瓶DNA修饰粉中。将小瓶涡旋2分钟或直至溶液澄清。检查小瓶中是否有任何不溶解的颗粒。如果存在颗粒,可将小瓶置于65℃下孵育2分钟并短暂涡旋。加入40μL平衡溶液并短暂涡旋。
  3. 在步骤1孵育后,将125μL来自步骤2的制备溶液加入到DNA样品中。涡旋并在65℃下孵育90分钟。

 

修改后的DNA纯化

  1. 将离心柱放入包含修饰的样品的2 ml无盖收集管中。
  2. 向离心柱中加入300μL捕获溶液,使溶液在柱上静置1分钟。
    :在将离心柱放入微量离心机之前,始终盖上离心柱。
  3. 将来自DNA修饰步骤3的修饰后DNA溶液添加至已含有捕获溶液的离心柱上。将柱12,000×g离心20秒。弃去流出液体。
    :所有离心均为12,000 x g
  4. 将200μL经乙醇稀释的清洗溶液加入离心柱中并离心20秒。
  5. 在离心柱底部加入50μL 平衡/ 乙醇清洗溶液。确保气泡不会阻碍液体流入柱式滤芯。在室温下孵育8分钟。孵育后,离心20秒并弃去流出液体。
  6. 向离心柱中加入200μL 90%乙醇溶液,离心20秒钟,弃去流出液体。
  7. 向离心柱中加入200μL 90%乙醇溶液并离心40秒。弃去2 ml无盖收集管,将离心柱放入1.5 ml收集管中。
  8. 在离心柱底部加入8-20μL洗脱液。孵育1分钟,然后离心20秒。取下并弃去离心柱。洗脱后的溶液为修饰后的DNA。修饰后的DNA可用于下游测试,也可以在-20°C下保存长达2个月。

图1使用Imprint®MOD50和来自其他两家供应商的试剂盒,对低浓度人类基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰。然后使用β-肌动蛋白基因特异性引物(109 bp扩增子)对所有样品进行甲基化特异性PCR(MSP)。对于所有供应商试剂盒结果,从左到右的泳道分别为100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、50 pg和无样品。供应商C和D(未显示)没有适合50pg的产品。这些结果证明了Imprint®试剂盒相对于其他供应商产品更卓越的灵敏度。

 

故障排除
 

观察现象 原因 建议解决方案
DNA修饰效果很差




起始DNA不纯或是片段化的 确保DNA A260/280比率在1.6-1.9之间。可以通过凝胶电泳检查DNA的降解。 用高质量的DNA开始该分析。
DNA量不足 将起始DNA增加到建议用量。
DNA模板含有高GC含量或二级结构 将亚硫酸氢盐反应时间增加至150-180分钟。
DNA变性不足 确保在样品中添加足够的平衡溶液
温度不正确 检查孵育温度
DNA清洗不充分 确保在90%乙醇中加入足量的平衡溶液
DNA修饰粉末/ DNA修饰溶液/平衡溶液混合物的储存不正确 确保混合物储存在-20°C且不超过1周。
洗脱液中含有很少或没有DNA






起始DNA质量较低 通过凝胶电泳验证DNA是否被降解。
捕获溶液未添加至样品中 按照修饰后DNA清洗步骤2中的说明添加捕获溶液。
用70%乙醇而不是无水乙醇制备乙醇稀释的清洗溶液 确保在使用前将适量的无水乙醇加入清洗液中。
平衡/乙醇清洗液制备不正确 请参阅“试剂准备”部分。
柱未用90%乙醇洗涤 确保清洗溶液是90%乙醇
样品未完全通过过滤芯 在修改之前纯化DNA,并且对于所有离心步骤将离心时间增加至1分钟。
洗脱液包含未修饰和修饰的DNA DNA的量超出推荐范围 将起始DNA的量调整至50-200 ng范围
模板具有高GC含量 将亚硫酸氢盐反应时间增加至150-180分钟

常问问题解答(FAQ)

一步法DNA修饰和两步法DNA修饰有什么区别?

在一步法DNA修饰中,DNA通过加热变性,这使得DNA变性和亚硫酸氢盐修饰可以同时进行。由于一步法DNA修饰可能会增加DNA降解的几率,因此该方法最适合更大DNA含量(10 ng至1μg)的样品。在两步法DNA修饰中,DNA经化学变性,然后进行亚硫酸氢盐处理。对于较低含量(100 pg至10 ng)的DNA样品,建议使用此方法。两种试剂盒均适用于对各种来源分离的DNA进行修饰。

 

使用该试剂盒进行DNA修饰需要多少起始DNA?

DNA修饰所需的起始DNA可低至50 pg。可以用实时PCR检测修饰后DNA的信号。

 

为什么DNA修饰只需要90分钟?

使用我们独特的改性组分,90分钟足以进行99%以上的C-U转化,同时极大地防止DNA降解。我们观察到修饰时间的增加并未显着增加C-U转化,而修饰DNA的产量却显著降低,其最可能的原因是DNA降解的增加。

 

修饰的DNA可以存储多长时间?

用该试剂盒产生的修饰DNA可在-20°C下保存2个月,在-80°C下保存6个月。

 

该试剂盒可用于修饰从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品中分离的DNA吗?

可以。然而,重要的是要注意一些固定方法会严重降解DNA。因此,我们建议用户在亚硫酸氢盐处理前尝试扩增目的基因。如果基因可以扩增,我们建议对FFPE样品使用两步法。Imprint亚硫酸氢盐修饰试剂盒包含DNA稳定试剂,其可最大限度地减少样品降解。

 

材料

     

  

需自备的材料