通过qPCR设计案例研究为新型冠状病毒科研提供支持

现有检测支持

我们正与公共卫生领域权威机构及客户紧密携作,为抗击新型冠状病毒 (新型冠状病毒)疫情提供支持。为了满足相关领域对新型冠状病毒特异性试剂及实验方法的需求,我们的科学家已经设计出了针对新型冠状病毒的qPCR检测方案(见下表1)。请注意所有的工作都均来自于计算数据;目前尚无来自实验室的数据。

关于检测方案设计及反应性的特别注意事项

新型冠状病毒与SARS病毒具有95%同源性,故交叉反应的风险较高。在利用表1进行检测设计时,请留意以下事项:

  1. 所有检测设计尚未在GenBank中发现与人类或细菌基因组或mRNA序列存在交叉反应。
  2. 1号及2号两种SYBR Green检测未与其他任何病毒完全比中,但可能会识别带有2-3个错配碱基的SARS病毒。
  3. 3-6号双重标记探针检测可并行使用以消除交叉反应性问题。
    1. 3号及4号检测未与其他任何病毒完全匹配,但仍可能会识别带有几个错配碱基的其他病毒(大部分情况下是SARS)。由于这些设计都针对高度保守区域设计,因此能够可靠地用于新型冠状病毒检测,但也可能产生假阳性结果。
    2. 5号及6号检测与包括SARS在内的其他任何病毒都不存在反应性,因此应该能够特异性地检测新型冠状病毒;但由于这些检测是针对高度可变区域进行设计,因此可能并不能检测出所有的变异体。
    3. 因此,3号和4号可用于阳性检出,而5号和6号可用于排除假阳性。

表1. 新型冠状病毒 qPCR检测方案
 

方案 检测方法 正向引物 反向引物 探针 探针序列
1 SYBR® Green GCCTCTTCTCGT
TCCTCATCAC
AGCAGCATCACCG
CCATTG
   
2 SYBR® Green AGCCTCTTCTCG
TTCCTCATCAC
CCGCCATTGCCAG
CCATTC
   
3

双重标记探针

CCGCAAGGTTCT
TCTTCGTAAG
TGCTATGTTTAGT
GTTCCAGTTTTC
A AAGGATCAGTGCC
AAGCTCGTCGCC
4 双重标记探针 GGCTTACCGCAA
GGTTCTTC
TGCTATGTTTAGT
GTTCCAGTTTTC
A AAGGATCAGTGCC
AAGCTCGTCGCC
5

双重标记探针

CAGGTATATGCG
CTAGTTATCAGAC
CCAAGTGACATAG
TGTAGGCAATG
B AGACTAATTCTCC
TCGGCGGGCACG
6

双重标记探针

GCAGGTATATGC
GCTAGTTATCAG
ACACTGGTAGAAT
TTCTGTGGTAAC
B AGACTAATTCTCC
TCGGCGGGCACG

SARS与新型冠状病毒阳性对照对比

为了更好地将SARS病毒与新型冠状病毒 进行区分,我们设计了如下SARS阳性对照检测(见下表2)。在利用表2进行实验设计时,请留意以下事项:

  1. 该检测针对SARS基因组的高度保守区域而设计,可检测多种SARS变异体。
  2. 该检测并不识别任何人类、细菌或其他病毒序列,包括SARI。

表2. SARS阳性对照qPCR检测  
 

方案 检测方法 正向引物 反向引物 探针 探针序列

SARS阳性对照

双重标记探针

GCTGTGTGTTTGC
CTATGTTGG
ACGTTCACGACTC
AGTATCTCAAG

SARS对照

AGCGTGCCTACTG
GGTTCCTCGTGC

新型冠状病毒引物及探针设计

这些引物及探针设计可通过下表下载,并可填写所需规格,然后通过我们的定制寡核苷酸和qPCR探针在线订购服务提交。如需更多信息,请联系oligotechserv@sial.com
 

RT-PCR及RT-qPCR基因分析和辅助型试剂

我们承诺向参与新型冠状病毒疫情的研究人员提供及时的试剂和专业技术知识支持。不妨了解一下我们适用于新型冠状病毒疫苗研究的全球顶级RT-PCR、RT-qPCR及辅助型试剂。

TranscriptorOne-Step RT-PCR试剂盒

TranscriptorOne-StepRT-PCR试剂盒基于热启动一步法RT-PCR技术,含有包括Taq DNA聚合酶和一款带有校正功能的聚合酶在内的酶混合物,能够确保灵敏而稳健的逆转录反应。该试剂盒可提供除模板和引物之外的所有一步法RT-PCR所需组分。

KAPA PROBE FAST One-Step(目前不在美国销售)

KAPA PROBE FAST One-Step专为高通量、快速循环的一步法RNA定量而设计。适用于所有基于荧光探针的技术,包括杂交探针(如FRET)、水解探针(如TaqMan®)和置换探针(如分子信标)。

Titan™ One Tube RT-PCR系统

Titan™ One Tube RT-PCR系统中含有三种酶的混合物,其中AMV逆转录酶用于第一模板cDNA合成,而由Taq DNA聚合酶以及另外一款带有校正活性的聚合酶所组成的Expand™高保真混合酶则用于基于PCR的cDNA扩增。

Quantitative RT-PCR ReadyMix™

除用于第一模板cDNA合成的Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV RT)外,Quantitative RT-PCR ReadyMix™还混有JumpStart Taq DNA聚合酶、99%纯脱氧核苷酸、缓冲液、稳定剂,并以2x浓度的便捷形式提供。

KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™

KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™适用于所有的双重标记探针试剂,含有除RNA模板和探针之外的所有RT-qPCR所需组分。可以含/不含有ROX™参比染料的形式提供。

表3. RT-PCR、RT-qPCR及辅助试剂
 

描述
货号
Transcriptor One-Step RT-PCR试剂盒 TOSRTRO
KAPA PROBE FAST One-Step KK4752
Titan™ One Tube RT-PCR系统 11855476001
Quantitative RT-PCR ReadyMix™ QR0200
KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ KCQS07
KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™,低ROX™版 KCQS08
KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™,ROX™版 KCQS09
分子级无核酸酶水 W4502


我们将持续关注事态并与客户紧密合作,为应对此次WHO全球卫生突发事件提供支持。烦请宣传我们的新型冠状病毒 qPCR检测引物及探针组合。联系我们获取新型冠状病毒疫苗开发紧急支持。