不使用去垢剂提取核蛋白的实验方案

去垢剂可以干扰提取的蛋白质的标记效率。因此,应该使用不含去垢剂的方法来制备核蛋白。

CellLytic™ NuCLEARTM 提取试剂盒(产品编号:NXTRACT)可用于制备核蛋白。务必使用不含去垢剂的程序。用该试剂盒制备的核蛋白提取物需要透析调节pH,之后才能用Cy染料标记。

以下程序为试剂盒中的非去污剂程序,用于从200 μL细胞压积(PCV)中提取蛋白质。对于不同的细胞压积,进行相应的计算。

注意:以下程序描述了使用注射器或玻璃组织匀浆器制备核提取物粗品。该操作程序需要至少100 μL的PCV。对于小规模制备(0.1-1 mL),建议使用注射器。由于针头的尺寸,超过1 mL的量可能难以通过注射器。

从细胞提取

  1. 用超纯无菌水制备0.1 M DTT的新鲜溶液。
  2. 制备裂解缓冲液:
        • 低渗:10 mM HEPES,pH 7.9,含1.5 mM MgCl2和10 mM KCl。
        • 等渗(或从脆弱细胞提取蛋白质):10 mM Tris HCl,pH 7.5,含2 mM MgCl2,3 mM CaCl2,0.3 M蔗糖。
  3. 向1,400 μL裂解缓冲液(低渗或等渗)中加入14 μL 0.1 M DTT溶液和14 μL蛋白酶抑制剂混合物。
  4. 制备提取缓冲液:20 mM HEPES,pH 7.9,含有1.5 mM MgCl2,0.42 M NaCl,0.2 mM EDTA,25%(v/v)甘油。

从贴壁细胞提取

  1. 使细胞生长至70-80%汇合度。
  2. 去除细胞的生长培养基。
  3. 用PBS冲洗细胞两次,注意不要使任何细胞脱落。
  4. 丢弃PBS。使用新鲜的PBS刮擦细胞,并收集到合适的锥形离心管中。
  5. 以450 × g离心5分钟。
  6. 倒掉上清液。
  7. 估计细胞压积(PCV)。
  8. 继续执行非贴壁细胞操作程序的第7步。

从非贴壁细胞提取

  1. 将细胞收集到合适的锥形离心管中。
  2. 以450 × g离心5分钟。
  3. 倒掉上清液。
  4. 将细胞洗涤两次,具体操作是:将细胞沉淀重悬于PBS中,并以450 × g离心5分钟。
  5. 倒掉上清液。
  6. 估计细胞压积(PCV)。
  7. 将1 mL(5X PCV)裂解缓冲液(包括DTT和蛋白酶抑制剂)加入到200 μL PCV中。
  8. 轻轻重悬细胞沉淀。避免起泡。如果使用小体积,可以将悬浮的细胞转移到微量离心管中。
  9. 将压实的细胞在裂解缓冲液中孵育15分钟,使细胞膨胀。
  10. 将悬浮的细胞以420 × g离心5分钟。倒出上清液,并将压实的细胞的沉淀重悬于400 μL(2X PCV)的裂解缓冲液中。
  11. 使用玻璃组织匀浆器,将细胞转移到玻璃组织研磨管中。在冰上,用B型杵慢慢地上下研磨5次。避免起泡。
    或者
    使用带有小号(27号)皮下注射针头的注射器,在注射器中注入裂解缓冲液。注射器柱塞用来尽可能完全排出缓冲液。这样可以从注射器中除去所有空气,并防止过量空气在裂解过程中被泵入细胞悬液。将细胞悬液缓慢吸入注射器,然后快速一次推到底喷出溶液。重复做五次。
    注意:
        • 所需的抽推次数(使用组织匀浆器或注射器)视细胞系的不同而不同。从抽推5次开始
          然后在显微镜下检查裂解情况。裂解应达到80-90%。如果裂解不充分,请再抽推几次
          反复抽推,直到完全裂解。
        • 在等分细胞试样中加入台盼蓝溶液可以观察到裂解。染料不染色完整细胞,但染色裂解的细胞的细胞核。如果可见核裂解或核团,或者观察到凝胶状物质,则说明细胞破裂太严重,或者抽推次数太多。
  12. 将含有破裂细胞的悬浮液以10,000-11,000 × g离心20分钟。
  13. 将上清液转移到新管中。该部分是细胞质部分。
  14. 向147 μl提取缓冲液加入1.5 μL 0.1 M DTT溶液和1.5 μL蛋白酶抑制剂混合物。
  15. 将粗品核沉淀重悬于~140 μL(2/3X PCV)含有DTT和蛋白酶抑制剂的提取缓冲液中。如果操作程序使用的是组织匀浆器,则建议此时再多抽推10次。
  16. 轻轻摇动30分钟。
  17. 以20,000-21,000 × g离心5分钟。
  18. 将上清液转移到干净、冰冷的管中。
  19. 进行透析,或储存于-70°C。

从组织提取

以下操作程序用于从100 mg组织提取核蛋白。对于不同重量的组织,进行相应的计算。

  1. 用超纯无菌水制备0.1 M DTT的新鲜溶液。
  2. 制备裂解缓冲液
        a. 用超纯无菌水制备0.1 M DTT的新鲜溶液。
        b. 制备裂解缓冲液:
            • 低渗:10 mM HEPES,pH 7.9,含1.5 mM MgCl2和10 mM KCl。
            • 等渗(或从脆弱细胞提取蛋白质):10 mM Tris HCl,pH 7.5,含2 mM MgCl2,3 mM CaCl2,0.3 M蔗糖。 
        c. 向1,400 μL裂解缓冲液(低渗或等渗)中加入14 μL 0.1 M DTT溶液和14 μL蛋白酶抑制剂混合物。
    注意:对于我们所测试的组织,低渗缓冲液比等渗缓冲液更好。如果发现组织太脆弱,可以使用等渗裂解缓冲液。
  3. 制备提取缓冲液
        a. 制备提取缓冲液:20 mM HEPES,pH 7.9,含有1.5 mM MgCl2,0.42 M NaCl,0.2 mM EDTA,25%(v/v)甘油。
        b. 将1.5 μL制备的0.1 M DTT溶液和1.5 μL蛋白酶抑制剂混合物加入到147 μL的提取缓冲液中。
  4. 用PBS缓冲液冲洗组织两次。丢弃PBS。
  5. 将组织轻轻重悬于1 mL(5X PCV)含有DTT和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。
  6. 使组织均匀化(使用组织匀浆器)直至超过90%的细胞破裂,并且在显微镜下看到细胞核。
  7. 将破裂的细胞以10,000-11,000 x g离心20分钟。
  8. 将上清液转移到新管中。该部分是细胞质部分。
  9. 将粗品核沉淀重悬于~140 μL(2/3X PCV)含有DTT和蛋白酶抑制剂的提取缓冲液中。在此阶段,可以进行短暂的均质化以促进核提取。
  10. 轻轻摇动30分钟。
  11. 以20,000-21,000 × g离心5分钟。
  12. 将上清液转移到干净、冰冷的管中。
  13. 进行透析,或储存于-70°C。

透析

在执行标记程序(参见样品标记及处理)之前,必须通过透析使提取物达到所需的pH值。

  1. 制备0.1 M,pH 9.5-9.6,碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(将2个胶囊的产品编号:C3041溶解于100 mL水中)。
  2. 在体积为核蛋白提取物体积1000倍的透析缓冲液中,在4℃下透析2小时。 
  3. 将透析缓冲液更换为新制备的碳酸盐缓冲液,并在4℃下再透析2小时。根据Bradford程序确定蛋白质浓度。

 材料