硫醇修饰寡核苷酸还原方案

本方案将巯基修饰的寡核苷酸的二硫键还原为活性巯基形式(图1)。巯基可用于将寡核苷酸附着在固体表面,如金纳米颗粒。

二硫键还原5'-硫醇修饰剂C6 S-S寡核

图1. 二硫键还原5'-硫醇修饰剂C6 S-S寡核苷酸实例。硫醇修饰的寡核苷酸以二硫化物的形式运输,以防止自发的、不受控制的氧化,进而导致二聚体的形成,从而使寡核苷酸失效。


 定义/缩写

  • DTT – 二硫苏糖醇


 设备

  • 不适用


 耗材

  • 2 mL离心管
  • 移液器吸头
  • Milli-Q® H2O
  • DTT (货号 D9779)
  • NAP?-10 柱 (货号 GE17-0854-01)
  • 磷酸钠缓冲液
  • 硫醇修饰的寡核苷酸


 分析方法

该方法分为两个步骤:1)硫醇形成; 2) 副产物去除。

硫醇形成

  1. 制备溶于100mM磷酸钠缓冲液中的100mM DTT溶液,pH 8.3 - 8.5。如需制备5mL,在缓冲液中溶解77.13mg DTT。
  2. 若达到12.5 OD(光密度单位;若> 12.5 OD,保持DTT溶液比寡核苷酸OD比例为10:1),将硫醇修饰的寡核苷酸溶解于125µL的DTT溶液中。
  3. 在室温下孵育1小时。
副产物去除
  1. 用大约15mL的100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)平衡NAP-10柱。等待平衡缓冲液完全进入柱床。
  2. 将1.0 mL的反应混合物加入NAP-10柱中(用磷酸钠缓冲液补足反应混合液的体积至1.0 mL,按需要调pH至6.0)。让反应混合物完全进入柱床。
  3. 将巯基修饰的寡核苷酸洗脱到离心管中,加入1.0 mL pH 6.0的磷酸钠缓冲液。


 其他说明

根据实验室标准操作方法,分别制备pH 8.3 - 8.5和6.0的磷酸钠缓冲液。用Milli-Q水配制所有缓冲液。


 材料