阳离子脂质体的制备和细胞转染

设备和材料

  • 18:1 (Δ9-Cis) PE (DOPE)
  • 阳离子脂质体
  • 氯仿
  • 蒸馏水
  • 缓冲液
  • 具有聚四氟乙烯密封环的玻璃瓶
  • 玻璃注射器
  • 氮气或氩气
  • 真空系统
  • 0.22µm滤膜(可选)

实验步骤

  1. 使用氯仿将各种脂质成分(如DOTAP/DOPE)溶解至方便的工作浓度(1-10mg/mL)。
  2. 使用玻璃注射器将所需体积的各种成分分装到玻璃瓶中。了解关于处理脂质有机溶液的更多信息。
  3. 将玻璃瓶中的成分充分混匀。
  4. 使用氮气流或氩气流小心蒸发氯仿(充分通风)。
  5. 将残留脂质抽真空10-15分钟,以去除所有残留有机溶剂。
  6. 将玻璃瓶从真空泵上取下,并立即悬浮于蒸馏水中,将浓度调整为脂质终浓度的2倍。
  7. 对脂质分散系统进行水浴超声处理,直至溶液澄清(2-5分钟)。
  8. 加入等体积缓冲液(如,308mM NaCl,40mM Hepes,pH7.4),并继续超声2分钟。
  9. 使用0.22µm滤膜对溶液进行过滤除菌。

脂质/DNA混合物的制备

  1. 将阳离子脂质分散系统与DNA(1µg DNA/10µg脂质)一起放置于合适的容器中。
  2. 在室温下,孵育脂质/DNA混合物5分钟。
  3. 5分钟后,混合物即可用于细胞转染。

细胞转染

  1. 使用HEPES缓冲生理盐水洗涤单层细胞两次。
  2. 在37°C下,使用HEPES缓冲生理盐水将细胞和脂质/DNA混合物(每个100 mm培养瓶添加3 ml混合物)一起孵育90分钟。
  3. 孵育结束后,根据需要替换培养基或补充培养基。
  4. 培养细胞一定时间,然后收集细胞。

注意

  • 常用的DOPE:阳离子脂质摩尔比为3:1和1:1。在某些情况下,完全由阳离子脂质构成的脂质系统已被用于转染细胞。
  • 引用的缓冲液系统专用于体外实验,并不代表该系统也适用于体内应用。

参考文献

  • Leventis, R., & Silvius, J.R. (1990). Biochim. Biophys. Acta 1023: 124-132.