引物浓度优化实验方案

qPCR条件的优化

qPCR条件的优化对于开发稳健的测定非常重要。优化不良的表现是,重复实验的再现性不良,而且测定效率低下和不敏感。所采用的两种主要方法是优化引物浓度和/或退火温度。

优化引物浓度的一种方法是建立一个反应阵列。该阵列用来对照伴侣引物的不同浓度来测试每种引物的一系列浓度。本实验方案给出的示例是用一个6×6阵列测试六种浓度(例如50 nM至800 nM)。本实验方案所述的数量都允许每个条件一式两份运行。


 设备

  • 定量PCR仪器
  • PCR设置的层流罩(选购件)

 试剂

  • 合适的测定模板,例如1:10稀释的cDNA、gDNA或合成的寡核苷酸模板。
  • KiCqStar tSYBR® Green ReadyMix™(KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03 — 取决于仪器,有关仪器兼容性,请参见表P4-6)。
  • PCR级水:PCR级水(W1754W4502),20 mL等分试样;冷冻;每次反应都使用新鲜的等分试样。
  • 正向和反向引物浓缩原液(10 μM工作原液)。

表P13-31. SYBR Green PCR Mix选择指南。
 

热启动ReadyMixes(Taq、缓冲剂、dNTPs、参比染料、MgCl2
KiCqStart® SYBR®Green qPCR ReadyMix™, 
货号:KCQS00
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ ,低Rox含量, 
货号:KCQS01
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 含ROX, 
货号:KCQS02
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ ,用于iQ, 
货号:KCQS03
兼容的仪器: 兼容的仪器: 兼容的仪器: 兼容的仪器:
Bio-Rad CFX384™ Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 5700 Bio-Rad iCycler iQ™
Bio-Rad CFX96™ Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 7000 Bio-Rad iQ™5
Bio-Rad MiniOpticon™ Fast Applied Biosystems ViiA 7 Applied Biosystems 7300 Bio-Rad MyiQ™
Bio-Rad MyiQ™ Stratagene Mx3000P® Applied Biosystems 7700  
Bio-Rad/MJ Chromo4™ Stratagene Mx3005P™ Applied Biosystems 7900  
Bio-Rad/MJ Opticon 2 Stratagene Mx4000™ Applied Biosystems 7900 HT Fast  
Bio-Rad/MJ Opticon®   Applied Biosystems 7900HT  
Cepheid SmartCycler®   Applied Biosystems StepOnePlus™  
Eppendorf Mastercycler® ep realplex   Applied Biosystems StepOne™  
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s      
Illumina Eco qPCR      
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000      
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000      
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q      
Roche LightCycler®480      


 耗材

实验方案说明

  • 使用随机引物或oligo-dT引发方法产生cDNA,并以1:10稀释备用,但也可以使用任何合适的替代模板。
  • 根据板的布局,所有样品一式两份运行(图P13-18)。

 

图P13-18. 引物优化板布局示意图。

引物优化板布局示意图。


 方法

注意:将2.0 μL的每种引物加入到总体积为20 μL的反应物中。为此,需要10倍所需浓度原液才能达到所需的最终浓度。

1.    使用10 μM引物原液,将两种引物原液稀释至0.5、1、2、4、6和8 μM,如表P13-32所示。

表P13-32. 引物浓度优化的引物稀释方案。
 

终浓度 (μM) 体积 (μL)
H2O
体积 (μL)
10 μM原液
总体积 (μL)
0.5 47.5 2.5 50
1 45 5 50
2 40 10 50
4 30 20 50
6 20 30 50
8 20 80 100

 

2.    根据表P13-33制备qPCR预混液。(注意:在步骤5中分别添加模板和cDNA)。充分混合。

表P13-33. 引物浓度优化反应预混液。
 

试剂 每次单次20 μL反应的体积 (μL) 整个板的体积 (μL)
(84 + 10%移液误差)    
2× KiCqStart SYBR® Green qPCR
ReadyMix
10 924
PCR级纯水 3 277.2
参比染料(非必需) 1 92.4
模板,例如cDNA(原液1:5至1:10稀释) 2 *
正向引物 2 *
反向引物 2 *

* 注意:在步骤5之前不要添加cDNA和引物。

 

3.    将步骤2中的184.8 μL预混合物(对12× NTC)移入单独的管中,用来设置无模板对照(NTC)反应。

4.    将26.4 μL的dH2O添加到步骤3中的NTC混合物中(以替换模板)。
       注意:将NTC混合物置于冰上以备后用。

5.    将158.4 μL cDNA模板添加到步骤2中剩余的预混液中。将预混液置于冰上。

6.    根据图P13-18,将2.0 μL适当的反向引物稀释液添加至PCR板中,再将800 nM浓度溶液添加到NTC行。

7.    根据图P13-18,将2.0 μL适当的正向引物稀释液添加至PCR板中。

8.    将步骤5中的16 μL预混液等分到PCR板上对应测试反应位置的孔中。

9.    将步骤4中的16 μL 预混液等分到PCR板NTC反应孔中。

10.    封板并贴好标签。(确保标签不会遮挡仪器的激发/检测光路。)

11.    按照表P13-34中的两步实验方案运行样品。重复执行第1-2步40次,然后进行解离曲线分析。

表P13-34. 引物浓度优化的PCR循环条件。
 

循环条件 温度 (°C) 时间 (sec)
初始变性 / 热启动 95 30
重复执行第1-2步40次。
第1步 95 5
第2步 60 30

 

说明:使用标准解离曲线实验方案(数据收集)。


 材料