阳离子脂质/寡聚物复合物的制备流程

基本原理

脂质:DNA复合物的常规制备流程需要将阳离子脂质悬浮于缓冲水溶液并超声,使其形成小囊泡。将阳离子脂质囊泡与DNA水溶液混合,其中,脂质与DNA的重量比为10:1,并孵育一定时间。在孵育期间,假设带正电的脂质体包被在DNA表面,在DNA表面形成的阳离子脂质层能够促进DNA与细胞膜之间的相互作用以及跨膜转移。然而,带有小DNA片段或寡聚物(如反义DNA)的DNA颗粒通常比脂质颗粒小很多。在这种情况下,脂质不会包裹DNA,而是DNA包裹在脂质体的表面。这将破坏关键的脂质体:细胞表面相互作用,并抑制跨膜转移。为了高效包裹这些小DNA颗粒,应使用单体(或小聚集物)形式的脂质与DNA混合,其方法为:将脂质溶解于有机溶剂中,并将有机溶液分散于DNA水溶液中,或将脂质和DNA一起置于有机溶剂中孵育。所选溶剂为乙醇,因为它易于与水混合,并且悬浮液中的残留乙醇对生物系统无毒性。

 

实验步骤A(乙醇脂质溶液:寡聚物水溶液)

  1. 将阳离子脂质溶解于乙醇中。
    o    如果脂质样品储存于氯仿中,则使用干燥氮气或氩气蒸发氯仿,并将残留脂质抽真空1小时,从而去除残留氯仿。
    o    使用乙醇将干燥残留脂质完全溶解,如有需要,可适当加热(40-50°C)和超声。
    o    调整浓度,使添加到寡聚物水溶液中的乙醇脂质溶液体积占水溶液体积的10%。
  2. 将寡聚物溶解于合适体积的水性缓冲液中。
  3. 3. 将乙醇脂质溶液添加到寡聚物水溶液中,脂质与寡聚物的重量比为10:1。
    o    通过涡旋或超声将脂质:寡聚物悬浮液充分混匀。
    o    孵育悬浮液5-10分钟,形成脂质:寡聚物复合物。
    o    如果不希望出现残留乙醇,则将悬浮液加热至40-50°C,并向悬浮液中吹入氮气,直至将乙醇全部去除。
 

实验步骤B(乙醇脂质溶液:寡聚物乙醇溶液)

  1. 将阳离子脂质溶解于乙醇中。
    o    如果脂质样品储存于氯仿中,则使用干燥氮气或氩气蒸发氯仿,并将残留脂质抽真空1小时,从而去除残留氯仿。
    o    使用乙醇将干燥残留脂质完全溶解,如有需要,可适当加热(40-50°C)和超声。
  2. 将寡聚物溶解于合适体积的乙醇中。
  3. 合并乙醇溶液,脂质与寡聚物的重量比为10:1。
    o    通过涡旋或超声将脂质:寡聚物悬浮液充分混匀。
    o    孵育悬浮液5-10分钟,形成脂质:寡聚物复合物。
    o    使用干燥氮气、氩气、旋转蒸发仪等蒸发乙醇,并将残留脂质抽真空干燥1小时,从而去除残留乙醇。
  4. 将脂质:寡聚物复合物重悬于水性缓冲液中,并超声至分散。