蛋白质测定改良定量法


1.目标


建立改良定量法测定蛋白质的标准化方法。


2.范围

此程序适用于所有具有定量蛋白质测定规格且不含三氯乙酸(TCA)沉淀的产品。
 


3.定义
 

净化水-去离子水,电阻率> 或 =18 MΩ•cm@25ºC
 


4.讨论
 

铜 + 蛋白质

    碱性 pH>

铜-蛋白质复合物

酚试剂

 


5.责任

所有分析服务实验室人员都有责任按照书面程序进行操作。

 

6.安全

有关危险和合理的预防措施,请参阅安全数据表 (SDS)。
 


7. 流程

7.1 条件:
T = 25°C, A750nm, 光路 = 1 cm

7.2 方法:
色度

7.3 试剂:

7.3.1 0.85% 氯化钠溶液 (NaCl) 使用氯化钠溶液,0.85%,   产品编号 S0817 ,或使用氯化钠在纯化水中配制 100 mL,   产品编号 S9888

7.3.2 0.01%定量蛋白标准品 (WPS) 在试剂 7.3.1 中配制 10 mL,使用    产品编号 P0914   或按照《蛋白测定用工作蛋白标准品的配制》(操作规程 10-30-6802)配制的工作蛋白标准品。

7.3.3 经修改的定量试剂 (LOW) 在纯化水中复溶制备,按照标签说明书,一瓶 定量试剂,经修改,   产品编号 L1013   或    产品编号 L3540  。此溶液可保存约一个月或直到溶液变混浊。

7.3.4 蛋白质样品溶液(样品)在试剂7.3.1中制备含有10-100 mg蛋白质/ ml样品的溶液。

7.3.5 0.33 N Folin&Ciocalteu的苯酚试剂(F&C)使用2 N Folin&Ciocalteu的苯酚试剂(例如 产品编号 F9252)在纯净水中进行6倍稀释来制备溶液。充分混匀。
 

7.4 试验方法

抑制反应

将下列试剂移入合适的容器中(毫升):
 

  测试 标准品 1 标准品 2 标准品 3 标准品 4 标准品 5 空白
试剂 7.3.1  (NaCl) ----- 0.90 0.70 0.50 0.30 ----- 1.00
试剂 7.3.2  (WPS) ----- 0.10 0.30 0.50 0.70 1.00 -----
试剂 7.3.3  (LOW) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
试剂 7.3.4 (样品) 1.00 ----- ----- ----- ----- ----- -----

 

通过涡旋充分混匀,并在25°℃下孵育10分钟。 孵育时间必须至少为10分钟,以使铜溶液与肽键反应。如果需要,这个时间可长达 24 小时。
然后添加:

  测试 标准品 1 标准品 2 标准品 3 标准品 4 标准品 5 空白
试剂 7.3.5  (F&C) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50


通过涡旋充分混匀,并在25°C下孵育30分钟。孵育时间必须至少为30分钟但不超过60分钟,因为颜色发展将在30分钟后继续。所有标准品、样品和空白吸光度必须在短时间内在分光光度计上读取。
将溶液转移到合适的比色皿中,并使用合适的分光光度计记录的测试品、标准品和空白的 A750nm 。
 

7.5 计算

ΔA750nm 标准品= A750nm 标准品– A750nm 空白
将 ΔA750nm  标准品与 mg蛋白质的相对关系绘制称标准曲线。

样品测定:
ΔA750nm 测试品= A750nm 测试品- A750nm 空白
从标准曲线确定   m  g 蛋白质。
 m  g 蛋白质 =( m  来自标准曲线的g蛋白质)* (df)
df= 稀释因子
 

% 蛋白质 = (m g 蛋白质)* (100)
( m  g 固体/ml)

100= 换算成百分比
 

mg 蛋白/ml

(m g 蛋白质)

(ml 样品/ml)

 


8.参考文献和附件

8.1 Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L and Randall, R.J. (1951) J. Biol. Chem. 193, 265-275

8.2 Peterson, G.L. (1979) Analytical Biochemistry, 100, 201-220
 


9.审批

 

  打印名称 签名名称 标题 日期
编制者: Holly Chapman Holly Chapman 创建人 11/9/04
审核人: Rodney Burbach Rodney Burbach 分析服务主管 11/10/04
审核人: Gene McNaughton Gene McNaughton 质量保证 11/10/04

 

 材料