qPCR效率测定实验方案

 qPCR条件的优化

qPCR条件的优化对于开发稳健的测定非常重要。优化不良的表现是,重复实验的再现性不良,而且测定效率低下和不敏感。所采用的两种主要方法是优化引物浓度和/或退火温度。

优化了测定后,重要的是验证反应效率。在报告和比较测定方案时,此处信息非常重要。在本文的实验方案示例中,比较了在广泛和狭窄的cDNA浓度动态范围上的测定效率。在实践中,通常根据样品的预期目标范围来选择一个单个测试范围,因此可以根据实验要求调整给定的实验方案。在本文的示例中,使用10倍和2倍连续稀释液计算效率。标准曲线应包含目标基因的预​​期表达范围。注意,使用ReadyScript®RT试剂盒时,cDNA产量与RNA输入的比例是线性的,因此如果使用RT-qPCR系统的话,可通过下列操作将本文的实验方案改编成适用于那个系统的:1)稀释RNA,并运行RT反应;2)然后在每个得到的cDNA样品上运行qPCR(相关示例请参见逆转录)。然而,情况并非总是如此,并不适用于所有逆转录试剂盒或实验方案。在将此实验方案改编用于替代试剂盒之前,应进行验证。
 

 设备

  • 定量PCR仪器
  • PCR设置的层流罩(选购件)

 试剂

  • 用作标准曲线模板(例如cDNA、gDNA或合成模板)的DNA
  • KiCqStart SYBR® Green ReadyMix™ (Sigma KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03 — 取决于仪器,见表P4-6)。
  • PCR级水:PCR级水(W1754W4502),20 mL等分试样;冷冻;每次反应都使用新鲜的等分试样。
  • 测试基因的正向和逆向引物(10 μM的原种)。

表P17-42. SYBR Green PCR Mix选择指南。
 

热启动ReadyMixes(Taq、缓冲剂、dNTPs、参比染料、MgCl2
KiCqStart® SYBR®Green qPCR ReadyMix™, 
货号:KCQS00
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ ,低Rox含量, 
货号:KCQS01
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 含ROX, 
货号:KCQS02
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ ,用于iQ, 
货号:KCQS03
兼容的仪器: 兼容的仪器: 兼容的仪器: 兼容的仪器:
Bio-Rad CFX384™ Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 5700 Bio-Rad iCycler iQ™
Bio-Rad CFX96™ Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 7000 Bio-Rad iQ™5
Bio-Rad MiniOpticon™ Fast Applied Biosystems ViiA 7 Applied Biosystems 7300 Bio-Rad MyiQ™
Bio-Rad MyiQ™ Stratagene Mx3000P® Applied Biosystems 7700  
Bio-Rad/MJ Chromo4™ Stratagene Mx3005P™ Applied Biosystems 7900  
Bio-Rad/MJ Opticon 2 Stratagene Mx4000™ Applied Biosystems 7900 HT Fast  
Bio-Rad/MJ Opticon®   Applied Biosystems 7900HT  
Cepheid SmartCycler®   Applied Biosystems StepOnePlus™  
Eppendorf Mastercycler® ep realplex   Applied Biosystems StepOne™  
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s      
Illumina Eco qPCR      
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000      
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000      
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q      
Roche LightCycler®480      


 用品

实验方案说明

 方法

1. 按表P16-40制备足以进行40次反应的qPCR预混液。只进行32次反应,额外的液体作为移液出错时备用(表P16-41)。

表P16-40. 用于生成1:2和1:10标准曲线的反应预混液。

试剂 每次单次20 μL反应的体积 (μL) 40次反应的体积 (μL)
2× KiCqStart SYBR Green qPCR
ReadyMix
10 400
正向引物 (10 μM) 0.9 36
逆向引物 (10 μM) 0.9 36
PCR级纯水 3.2 128

2. 对DNA进行一系列1:10和1:2稀释,每个系列覆盖7个稀释点(见表P16-41. DNA稀释板布局)。

3. 向已标识好的孔中加入5 μL的适当的模板稀释液(参见表P16-41. DNA稀释板布局)。

表P16-41. 96孔板布局的前四列示意图,显示了标准曲线模板稀释的位置。所述稀释是相对于原始原液而言的。当使用人工模板时,可以计算拷贝数(相对于OD读数)。
 

 

DNA稀释板布局
板的列号 1 2 3 4 板的其余部分
 A 1 1 1 1  
B 0.1 0.1 0.5 0.5  
C 0.01 0.01 0.25 0.25  
D 0.001 0.001 0.125 0.125  
E 0.0001 0.0001 0.0625 0.0625  
F 0.00001 0.00001 0.03125 0.03125  
G 0.000001 0.000001 0.015625 0.015625  
H NTC NTC NTC NTC  

4. 每孔加入15 μL预混液(见表P16-41)。

5. 给试管盖上盖子,或密封好板子,并贴上标签。(确保标签不会遮挡仪器的激发/检测光路。)

6. 根据以下两步方案操作样品。重复执行第1-2步40次。接着
用标准解离曲线分析进行扩增。
 

表P16-42. 生成标准曲线的PCR循环条件。

循环条件 温度 (°C) 时间 (sec)
初始变性 / 热启动 95 30
重复执行第1-2步40次。
第1步 95 5
第2步 60 30

说明:使用标准解离曲线实验方案(数据收集)。
 


材料