使用 SYBR Green I 染料检测方案进行 qPCR 基因表达/拷贝数分析

qPCR 条件的优化

QPCR 条件的优化对于制定稳健的检测方案非常重要。优化不佳的表现是重复样本之间缺乏再现性,以及检测低效且不灵敏。两种主要优化方法是优化引物浓度和/或退火温度。

使用 SYBR Green I 染料检测一个或多个稳定内参基因的靶量是qPCR的常见应用。下面是一个可以适应特定实验需要的标准实验方案。


 实验目标

在对靶基因和内参基因进行 qPCR 检测优化后便可测量靶标的数量。如    数据分析   部分所述,确定目的基因 (GOI) 数与稳定内参基因 (s) 数之间的比率是确定的。在本例中,使用标准曲线确定拷贝数。但是,如果不使用标准曲线,相对数量也可以通过其他比较量化分析方法来确定(参见    数据分析  )。如果采用这种方法,则标准曲线可以省略,但所有测试样本都需增加一个校准样本。方案中包括标准引物浓度和退火温度,但应根据优化实验的结果进行调整(参见   引物浓度优化    和    使用温度梯度优化引物  )。


 设备

  • 定量 PCR 仪 
  • PCR层流罩(可选) 


 试剂

  • gDNA 10ng - 100ng或cDNA作为模板(低表达基因按1:2稀释,中高表达基因按1:10 - 1:100稀释)。
  • KiCqStart SYBR® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03——取决于仪器,参见
     表 P4-6)。
  • PCR 级水:PCR 级水(W1754 or W4502)分为20 mL 等分试样;冰冻;每次反应使用新鲜的等分试样。
  • 用于测试基因的正向和反向引物(10 μM储备)。
表 P17-42:SYBR Green PCR 混合选择指南
 
热启动预混液 (Taq,Buffer,dNTPs,参考燃料,MgCl2)
KiCqStart® SYBR®Green qPCR 预混液™, 
货号KCQS00
KiCqStart® SYBR® Green qPCR 预混液™ ,低含量 Rox , 
货号KCQS01
KiCqStart® SYBR® Green qPCR 预混液™ ,含ROX, 
货号KCQS02
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™,用于iQ探针, 
货号KCQS03
兼容仪器: 兼容仪器: 兼容仪器: 兼容仪器:
Bio-Rad CFX384™ Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 5700 Bio-Rad iCycler iQ™
Bio-Rad CFX96™ Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 7000 Bio-Rad iQ™5
Bio-Rad MiniOpticon™ Fast Applied Biosystems ViiA 7 Applied Biosystems 7300 Bio-Rad MyiQ™
Bio-Rad MyiQ™ Stratagene Mx3000P® Applied Biosystems 7700  
Bio-Rad/MJ Chromo4™ Stratagene Mx3005P™ Applied Biosystems 7900  
Bio-Rad/MJ Opticon 2 Stratagene Mx4000™ Applied Biosystems 7900 HT Fast  
Bio-Rad/MJ Opticon®   Applied Biosystems 7900HT  
cepheidsmartcycler®   Applied Biosystems StepOnePlus™  
Eppendorf Mastercycler®  ep realplex   Applied Biosystems StepOne™  
Eppendorf Mastercycler®  ep realplex2 s      
Illumina Eco qPCR      
Qiagen/Corbett Rotor-Gene®  3000      
Qiagen/Corbett Rotor-Gene®  6000      
Qiagen/Corbett Rotor-Gene®  Q      
Roche LightCycler®480      


 用品

本方案注意事项


 方法

1. 为每个引物对准备不同的qPCR反应混合物。为样品准备足够的混合物,标准
       曲线反应(下述 6 种稀释度),无模板对照物,全部一式两份,并多算额外10%
       以允许移液误差。

       例如,如果有 5 个测试样品,则需准备 (5 × 2) 样品混合物+(6 × 2) 标准曲线+(1 × 2)无模板对照物
        (NTC) =24 份反应物。因此每个引物对需准备 26.4 或 27 份反应混合物。

 表 P17-43:SYBR Green I 检测反应混合物。
 

试剂 体积 (μL)/每
20 μL 反应物
2×KiCqStart SYBR Green qPCR 预混液 10
正向引物 (10 μM) 0.9
反向引物 (10 μM) 0.9
PCR 级水 3.2

2. 将合适的标准曲线模板/cDNA进行1:10倍(或实验室适用稀释浓度)的连续稀释,以使每份稀释液均含有 20 μL 模板(共 6种稀释液)。 

3. 加入 5 μL 合适模板连续稀释液(标准曲线),样品测试 cDNA 或水 (NTC) 至指定 试管或孔板中。

4. 每管或每孔加入 15 μL反应混合物。 

5. 盖上盖子或密封 PCR 板和标签。(确保标签不会遮蔽仪器的激发/ 检测光路。)

6. 根据  表 P17-44 操作样本。

7. 如需指导,请参阅   数据分析   

 表 P17-44:生成标准曲线的 PCR 循环条件。
 

循环条件 温度 (℃) 时间(秒)
变性/热启动 95 30
步骤 1-2 重复 40 个循环
第 1 步 95 5
第 2 步 60 30


 材料