选择qPCR参照基因的实验方案

qPCR条件的优化

qPCR条件的优化对于开发稳健的测定非常重要。优化不良的表现是,重复实验的再现性不良,而且测定效率低下和不敏感。所采用的两种主要方法是优化引物浓度和/或退火温度。

基因表达数据的分析需要稳定的参考或上样控制。所述参考通常是一个或多个参照基因。合适的参照基因是指那些不受样品和实验处理差异影响的基因,必须为每个实验模型确定这些基因。当进行试验以选择稳定的参照基因时,所选择的基因必须来自不同的生物途径,并且它们的表达是独立调节的,这些要求至关重要。所有候选参照基因最好在选择的五个测试样品和五个对照样品上进行测试。


 设备

  • 定量PCR仪器
  • PCR装置的层流罩(选购件)

 试剂

  • 以1:100稀释的cDNA(更稀释的cDNA通常足以检测高表达的参照基因,对于中等表达的基因,使用1:10稀释)。
  • KiCqStart® SYBR® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03 — 取决于仪器,见表P4-6)。
  • PCR级水:PCR级水(W1754W4502),20 mL等分试样;冷冻;每次反应都使用新鲜的等分试样。
  • 测试参照基因的正向和反向引物(10 μM的原液)。注意:表P15-37中提供了合适的基因列表。这些可以用作KiCqStart® 引物,它们是预先设计的测定(引物序列随产品提供),如表中所示。

表P17-42. SYBR® Green PCR Mix选择指南。
 

热启动ReadyMixes(Taq、缓冲剂、dNTPs、参比染料、MgCl2
KiCqStart® SYBR®Green qPCR ReadyMix™, 
货号:KCQS00
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 低罗红霉素含量 , 
货号:KCQS01
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 含罗红霉素, 
货号:KCQS02
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 用于iQ, 
货号:KCQS03
兼容的仪器: 兼容的仪器: 兼容的仪器: 兼容的仪器:
Bio-Rad CFX384™ Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 5700 Bio-Rad iCycler iQ™
Bio-Rad CFX96™ Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 7000 Bio-Rad iQ™5
Bio-Rad MiniOpticon™ Fast Applied Biosystems ViiA 7 Applied Biosystems 7300 Bio-Rad MyiQ™
Bio-Rad MyiQ™ Stratagene Mx3000P® Applied Biosystems 7700  
Bio-Rad/MJ Chromo4™ Stratagene Mx3005P™ Applied Biosystems 7900  
Bio-Rad/MJ Opticon 2 Stratagene Mx4000™ Applied Biosystems 7900 HT Fast  
Bio-Rad/MJ Opticon®   Applied Biosystems 7900HT  
Cepheid SmartCycler®   Applied Biosystems StepOnePlus™  
Eppendorf Mastercycler® ep realplex   Applied Biosystems StepOne™  
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s      
Illumina Eco qPCR      
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000      
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000      
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q      
Roche LightCycler®480      


 耗材

实验方案说明

表P15-37. 可能的候选参照基因和KiCqStart® 产品代码(KSPQ12012)。
 

参照基因 小鼠 大鼠
CANX M_Canx_1 H_CANX_1 R_Canx_1
HPRT1 不适用 H_HPRT1_1 R_Hprt1_1
PGK1 M_Pgk1_1 H_PGK1_1 R_Pgk1_1
TBP M_Tbp_1 H_TBP_1 R_Tbp_1
YWHAZ M_Ywhaz_1 H_YWHAZ_1 R_Ywhaz_1
ATP5B M_Atp5b_1 H_ATP5B_1 R_Atp5b_1
SDHA M_Sdha_1 H_SDHA_1 R_Sdha_1
TUBB2B 不适用 H_TUBB2B_1 R_Tubb2b_1
UBC M_Ubc_1 H_UBC_1 R_Ubc_1
PPIA 不适用 H_PPIA_1 R_Ppia_1
GUSB M_Gusb_1 H_GUSB_1 R_Gusb_1
GAPDH 不适用 H_GAPDH_1 不适用
TUBA1A 不适用 H_TUBA1A_1 R_Tuba1a_1
ACTB M_Actb_1 H_ACTB_1 R_Actb_1


 方法

1.    计算每个参照基因所需的反应数。制备足以对每个样品进行两次反应的混合物。例如,如果测试5个试样和5个对照样品以及两个无模板对照(NTC)= 22个反应物。另外多制备10%的混合物以备发生移液错误时补充。

2.    根据表P15-38为每个参照基因引物对制备qPCR预混液。请勿在预混液中添加cDNA。混合均匀,避免气泡。

表P15-38. 用于参照基因选择的qPCR预混液。
 

试剂 每次单次20 μL反应的体积 (μL)
2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 10
正向引物 (10 μM) 0.9
反向引物 (10 μM) 0.9
PCR级纯水 3.2

3.    向标记好的管/孔中加入15 μL预混液。

4.    加入5 μL适当的模板(将用于NTC的样品或水加入到标记好的管/孔中)。

5.    给试管盖上盖子或封板,并贴上标签。(确保标签不会遮挡仪器的激发/检测光路。)

6.    根据以下三步方案操作反应物(表P15-39)。重复执行第1-3步40次。

7.    参见数据分析以分析数据,并确定最稳定的参照基因或基因组合。

表P15-39. 选择参照基因时所用的PCR循环条件。
 

循环条件 温度 (°C) 时间 (sec)
初始变性 / 热启动 95 30
重复第1-3步40次。
第1步 95 5
第2步 58 10
第3步 72 15

说明:使用标准解离曲线实验方案(数据收集)。


 材料