β-NAD和β-NADH的回收微量分析

1. 目标

建立β-NAD和β-NADH的回收微量分析的标准化操作步骤。

 

2. 适用范围

适用于可对β-NAD和β-NADH进行回收微量分析的所有产品。

 

3. 定义

3.1.纯水 – 经去离子系统处理的水,在25ºC的电阻率大于或等于18MΩ•cm

3.2. β-NADH =β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,还原形式

3.3. β-NAD =β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,氧化形式

3.4. MTT =  (3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑)

3.5. PES =吩嗪乙基硫酸盐

 

4. 讨论

β - NAD + 乙醇  乙醇脱氢酶  > β-NADH + 乙醛

β-NADH + MTT + PES → 显色染料 + β - NAD

 

5. 责任

所有分析服务实验室人员均有责任遵守本文所述流程。

 

6. 安全性

有关危险因素及合适的操作注意事项,参阅安全数据说明书(SDS)。

 

7. 操作步骤

7.1. 条件:PH = 7.8,T = 25°C,A570nm,光程 = 1 cm

7.2. 方法:连续光谱法速率测定

7.3试剂:

7.3.1.   1 M 二甘氨酸

采用二甘氨酸(Sigma-Aldrich货号B3876)和纯水配制163.2 mg/ml 溶液。可能需要涡旋加速溶解。须现配现用。

7.3.2.   200 proof乙醇

Sigma-Aldrich 货号459828 (ETOH)

7.3.3.   0.1 M 乙二胺四乙酸(EDTA)

采用纯水和乙二胺四乙酸四钠水合物(Sigma-Aldrich 货号ED4SS)配制41.6 mg/ml溶液。可能需要涡旋加速溶解。

7.3.4.   20 mM吩嗪乙基硫酸盐(PES)

采用纯水和吩嗪乙基硫酸盐( Sigma-Aldrich货号P4544)配制6.7 mg/ml溶液。校正特定批次的水含量。可能需要涡旋加速溶解。须现用现配并存放在冰上。此试剂会快速降解,因此请在溶解后两小时内使用。

7.3.5.   10 mM (3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT)

采用纯水和(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑(Sigma-Aldrich货号M2128)配制4.1 mg/ml溶液。校正特定批次的水含量。可能需要涡旋和/或超声振荡加速溶解。实验期间试剂务必遮光室温保存。

7.3.6.   0.045 mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,氧化形式(β-NAD)

采用低温纯水和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化形式,Sigma-Aldrich货号N1636)配制0.045 mM 溶液。校正特定批次的水含量。请使用A类容积式玻璃容器。可能需要超声处理加速溶解。此试剂应现配现用。

7.3.7.   待测溶液(试样

用低温纯水配制待测溶液,等待Δ A570nm/min ≤ 0.1的情况持续5分钟时间窗。此反应主要采用乙醇脱氢酶(ADH)进行。对于ADH,蛋白浓度通常为1-10 mg /ml之间。

7.3.8.   120 mM二甘氨酸,3.7% ETOH,5 mM EDTA (RC)

在A类容积式玻璃容器中,通过混合以下成分(ml)配制反应混合物:

 

  (RC)
试剂7.3.1 12.0
试剂7.3.2 (ETOH) 3.7
试剂7.3.3 (EDTA) 5.0
纯水 79.3

在25°C下,采用1 M 氢氧化钠(Sigma-Aldrich货号S2567)或1 M盐酸(Sigma-Aldrich货号H3162)将pH调节为7.8。

7.4. 操作步骤

7.4.1.   采用适宜的恒温分光光度计,在25°C下按照下表所列的具体顺序,依次将以下成分加入到适宜的反应容器中。试剂7.3.4、试剂7.3.5和试剂7.3.6应尽可能依次快速加入。可能需要进行多次浓度测试。

 

  空白样 试样1 试样2 标准样1 标准样2 标准样3
RC(试剂7.3.8) 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50
纯水 0.10 ------ ------ ------ ------ ------
试样(试剂7.3.7) ------ 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
PES (试剂7.3.4) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
MTT (试剂7.3.5) 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13
β-NAD (试剂7.3.6) ------ ------ ------ 0.005 0.010 0.015

立即倒置混匀,并记录6分钟内的A570nm增量。获取5分钟时间窗内的所有水平的Δ A570nm/min。

7.5.   计算

7.5.1.   标准曲线:

校正后的标准样A570nm/min = (标准样ΔA570nm/min – 空白样ΔA570nm/min – 试样ΔA570nm/min) 

其中:试样ΔA570nm/min为7.5.2中测定的所有试样校正后的ΔA570nm/min平均值。

Plot corrected Δ A570nm/minute of standards versus nanomoles of β-NAD/reaction mixture of standards and determine the slope, y-intercept and r-square value of the line. The r-square value should be 0.99 or better.

7.5.2.   试样测定:

校正后的试样ΔA570nm/min = (试样ΔA570nm/min – 空白样ΔA570nm/min)

使用标注曲线并对90%一致性试样结果求平均,确定β-NAD/试样的纳摩尔数。

 

ADH纳摩数尔

=

(0.100)(10.0)(mg 蛋白/mg 固体)(1,000,000)

试样

分子量


β-NAD摩尔数

=

β-NAD/试样纳摩尔数

ADH摩尔数

ADH /试样纳摩尔数



0.100 = 反应混合物中使用的试剂7.3.7(试样)体积(ml)
 
10.0 = 试剂7.3.7(试样)浓度(mg固体/ml)
 
mg蛋白/mg 固体 = 基于E1% 、280nm的蛋白测定结果。

1,000,000 = 从mg至ng的换算系数。

分子量 =试剂7.3.7(试样)分子量。马肝脏来源乙醇脱氢酶的分子量等于160,000,面包酵母来源乙醇脱氢酶的分子量等于 141,000。

 

7.5.3.  产品A3263参数适于回收微量分析β-NAD和β-NADH。适用于标准依据如下条件确定:由于A7011已经结合β-NAD和β-NADH,A3263理应有极少量结合β-NAD和β-NADH,则如果β-NAD/ADH的摩尔比低于A7011中的β-NAD/ADH平均摩尔比的1/10,则视为A3263适用。

 

8. 参考文献和附件

8.1. Blomquist, C.H., Arch. Biochem. Biophys., 122, 248, (1967)

8.2. Buhner, M. and Sund, H., Eur. J. Biochem., 11, 73, (1969)

 

9. 审批

本文档将采用DocCompliance (QUMAS)生成的电子审核、批准和签名。如果需要带有签名验证的硬拷贝,请打印“供使用”副本。

 

材料