REDExtract-N-Amp™ 植物PCR试剂盒实验方案

货号:XNAPSXNAPXNAPR

 

产品描述

Extract-N-Amp植物PCR试剂盒包含从植物叶片快速提取和扩增基因组DNA所需的所有试剂。简而言之,取一片叶片组织,采用标准打孔器打孔0.5-0.7 cm切片,然后在提取液中95 °C孵育10分钟,提取DNA,无需液氮冷冻植物组织、机械破碎、有机提取、柱纯化或DNA沉淀。将等体积的稀释液加入到加入抑制物质的提取液中,即可直接进行PCR。

随后将一份稀释提取液与REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix™及用户自备PCR引物混合,扩增靶标DNA。REDExtract-N-A mp PCR ReadyMix为含缓冲液、盐、Taq聚合酶的2X反应混合物。其专门针对反应试剂进行了优化。此外,这种试剂还含有支持热启动PCR的JumpStart™ Taq抗体(增强特异性)和REDTaq® 染料,方便将PCR产物直接上样到琼脂糖凝胶上。

 

随附试剂 货号 XNAPS
10次提取
10次扩增
XNAP
100次提取
100次扩增
XNAPR
1000次提取
1000次扩增
提取液 E7526 1.2 ml 12 ml 120 ml
稀释液 D5688 1.2 ml 12 ml 120 ml
REDExtract-N-Amp反应混合物 这是含有缓冲液、盐、dNTP、Taq聚合酶和JumpStart Taq抗体的2X PCR反应混合物 R4775 0.15 ml 1.2 ml 12 ml
2mL采样管 T5449 or T7813 非随附 2 X 50 each
非随附

 

自备试剂和设备

  • 打孔器
  • 镊子(中小款)
  • 95 °C的加热块或热循环仪
  • PCR引物
  • 水,PCR试剂,货号W1754

 

注意事项和免责声明

REDExtract-N-Amp植物PCR试剂盒仅供实验室使用,不用于药物、家用或其他用途。有关危险和安全处理方法的信息,请参阅安全数据手册。

 

存储

提取液、稀释液和REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix可在2至8 °C下短期储存;-20 °C下长期储存。请勿储存于“无霜”冰箱中。

 

操作步骤

 除非另有说明,否则所有步骤均在室温下进行。

 

A. DNA 提取

    1. 在使用前及处理不同样品的间隙,采用70%乙醇冲洗打孔器和镊子。

    2. 采用标准单孔打孔器打孔0.5 - 0.7 cm的圆孔样叶片组织,装入2 ml收集管

         如果使用冷冻叶片组织,在打孔时将叶片置于冰上。

    3. 将100 µL提取液加入收集管中。盖上管盖并短暂离心。确认也偏空已完全被提取液覆盖。

    4. 95 °C孵育10分钟。注意,通常情况下,此步处理后叶片组织不会出现降解。

    5. 加入100 µL稀释液,涡旋混合。

    6. 将稀释后的叶片提取液2-8 °C储存。储存前不必取出叶片孔样。

B. PCR amplification

REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix含有JumpStart Taq抗体,可用于特定的热启动扩增。因此,PCR反应可以在室温下进行而不会过早产生Taq DNA聚合酶活性。

最终引物浓度通常约为0.4 µM。最佳引物浓度和循环参数取决于所使用的系统。

    1.  将以下试剂加入薄壁PCR微量离心管或板中:

 

试剂 体积
PCR级水 X µL
Extract-N-Amp PCR反应混合物 10 µL
正向引物 Y µL
反向引物 Y µL
组织提取物 4 µL*
总体积 20 µL

*注意:REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix配方用于补充提取液和稀释液组分。如果添加到PCR反应体积中的叶片提取液少于4 µL,用50:50的提取液:稀释液混合物使组织提取物的体积达到4 µL。

     2.   轻轻混匀,短暂离心,在管底收集所有组分。

     3.    如果热循环仪没有加热盖,需在每管混合物的上部加入20 µL矿物油防止蒸发。

     4.    进应针对各个引物、模板和热循环仪优化扩增参数。

 

常见的循环参数:

 

步骤 温度 时间 循环次数
预变性 94 °C 3 min 1
变性 94 °C 0.5-1 min 30-35
退火 45 - 68 °C 0.5-1 min
延伸 72 °C 1-2 min (~1kb/min)
最后延伸 72 °C 10 min 1
保温 4 °C 不确定  

 

5.    PCR结束后,将扩增的DNA加到琼脂糖凝胶上。

       不必加入单独的上样缓冲液/示踪染料。

注:如果需要,可对PCR产物进行纯化,用于下游应用,例如使用GenElute™ PCR纯化试剂盒(货号NA1020)进行测序。

 

故障排除指南

 

问题 原因 解决方案
检测到很少或检测不到PCR产物。 植物提取物污染物抑制PCR反应。 用50:50的提取液和中和液混合物稀释组织提取物。为了检测抑制作用,需有DNA对照,并且/或者将已知量的模板(100-500个拷贝)与组织提取物一起进行PCR。
PCR组分丢失或降解。 运行阳性对照,确保组份正常有效。另外,构建反应时建议使用检查表。
执行的循环太少。 增加循环次数(每次增加5-10个循环)。
退火温度太高。 将退火温度以2-4 °C增量递减。
引物设计不佳。 确认序列信息准确。如果引物长度小于22个核苷酸,试着将引物延长到25-30个核苷酸。如果引物的GC含量低于45%,重新设计GC含量为45-60%的引物。
变性温度太高或太低。 将变性温度以1 °C增量递增或递减来进行优化。
变性时间太长或太短。 将变性时间以10秒增量递增或递减来进行优化。
延伸时间太短。 将延伸时间以1分钟增量递增,尤其是对于长模板。
靶标模板复杂。 大多数情况下,由于GC含量异常高和/或二级结构,靶标本就复杂。据报道,浓度为1.0-1.7 M的甜菜碱(货号B0300)有助于扩增GC含量高的模板。
多种产物 JumpStart Taq抗体无法正常作用。 不要将DMSO或甲酰胺与Extract-N-Amp PCR反应混合物一起使用。它会干扰酶-抗体复合物。其他助溶剂、溶质(如盐)和pH或其他反应条件的极端情况可降低JumpStart Taq抗体对Taq聚合酶的亲和力,从而降低有效性。
需要进行降落PCR。 “降落”PCR可显著提高许多PCR反应在各种应用中的特异性。降落PCR包括在初始PCR循环期间使用高于引物TM的退火/延伸温度。然后将退火/延伸温度降至引物TM进行剩余的PCR循环。可以在一个步骤中进行更改,也可以在几个周期内递减。
污染 试剂受到污染。 Sigma建议在每次进行PCR时使用不含DNA模板的空白试剂作为对照,以确定提取或PCR过程中使用的试剂是否被先前反应的模板污染。

 

购买者须知:有限许可证

本产品的使用受到如下一项或多项美国专利及其对应的境外专利声明保护:US: 5,789,224和5,618,711。购买本产品,即相当于依照境外的专利声明获得了一份受限制、不可转让的使用许可,即将此等数量的产品用于购买者内部的研究用途。我们未明确表示、暗示或以禁止反言的形式授予您任何其他专利声明下的权利、进行任何专利方法申请的权利、进行任何形式的商业服务的权利,包括但不限于出于收费或其他商业考虑而报告购买者的研究活动结果的权利。本产品仅适合于研究用途。如需用于Roche专利许可的诊断用途,需另外征得Roche许可。有关购买许可的更多信息,可联系Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA获取。

 

GenElute、JumpStart和REDExtract-N-Amp是Sigma-Aldrich Co. LLC的商标。

 

材料

   

     

   

参考文献

  1. Dieffenbach, C.W. and Dveksler, G.S. (Eds.) PCRPrimer: A Laboratory Manual, 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (2003). Catalog Number Z701270
  2. Don, R.H. et al. ‘Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res., 19, 4008 (1991).
  3. Erlich, H.A. (Ed.) PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, New York (1989).
  4. Griffin, H.G. and Griffin, A.M. (Eds.) PCR Technology: Current Innovations, CRC Press, Boca Raton, FL, 1994.
  5. Innis, M.A., et al. (Eds.) PCR Strategies, Academic Press, New York (1995).
  6. Innis, M., et al. (Eds.) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, California (1990).
  7. McPherson, M.J. et al. (Eds.) PCR 2: A Practical Approach, IRL Press, New York (1995).
  8. Newton, C.R. (Ed.) PCR: Essential Data, John Wiley & Sons, New York (1995).