TRI Reagent® 实验方案

产品编号:XNATSXNATXNATR

 

 概述

REDExtract-N-Amp组织PCR试剂盒包含从小鼠尾巴和其他动物组织、口腔拭子、毛干和唾液中快速提取和扩增基因组DNA所需的所有试剂。简而言之,在室温下将样品与提取溶液和组织制备溶液的混合物孵育10分钟,原料即可释放DNA。不需要机械破碎、有机提取、柱纯化或DNA沉淀。 

加入中和溶液B后,提取物可用于PCR。然后将等分的中和后的提取物与REDExtract-N-Amp PCR反应混合物和用户提供的PCR引物组合,即可扩增靶DNA。REDExtract-N-Amp PCR反应混合物是含有缓冲液、盐、dNTP和Taq聚合酶的2X反应混合物。它专门针对提取试剂而进行了优化。它还含有JumpStart™ Taq抗体(用于热启动PCR以增强特异性),以及REDTaq® 染料(以将PCR产物直接加载到琼脂糖凝胶上)。
 

提供的试剂 货号 XNATS
10份制剂,
10份PCR
XNAT
100份制剂,
100份PCR
XNATR
1000份制剂,
1000份PCR
提取溶液 E7526 2.5 ml 24 ml 240 ml
组织制备溶液 T3073 0.3 ml 3 ml 30 ml
中和溶液B N3910 2.5 ml 24 ml 240 ml
REDExtract-N-Amp PCR反应混合物
这是含有缓冲液、盐、dNTP、Taq聚合酶、REDTaq染料和JumpStart Taq抗体的2X PCR反应混合物。
R4775 0.15 ml 1.2 ml 12 ml

 

需要但未提供的试剂和仪器:

  • 微量离心管(1.5或2 ml)或多孔板用于提取(200 μl最小孔容积)
  • 剪刀,微型切割,货号:Z265985
  • 镊子(中小型)
  • 口腔拭子(无菌泡沫尖涂抹器,货号:A9601
  • 样品采集卡 — 血迹卡,货号:C2613
  • 用于PCR的管或板
  • 95°C加热块或热循环仪
  • PCR引物
  • 热循环仪
  • 水,PCR试剂,货号:W1754

 操作步骤

除非另有说明,否则所有步骤均在室温下进行。 A. 从小鼠尾巴、动物组织、毛发或唾液中提取DNA

  1. 移取100 μL提取溶液到微量离心管或多孔板的孔中。向管或孔中加入25 μL组织制备溶液,上下移液混合。

    注意:如果要进行多次提取,可以在使用前最多2小时以4:1的比例预先混合足量的提取和组织制备溶液。
     
  2. 对于新鲜或冷冻的小鼠尾巴:在使用之前和不同的样品之间,用70%乙醇冲洗剪刀和镊子。将0.5-1 cm的小鼠尾尖(切割端向下)放入溶液中。通过涡旋或移液彻底混合。确保小鼠尾巴浸没在溶液中。

    注意:对于新鲜小鼠尾巴,请在剪断尾巴后30分钟内进行提取。

    对于动物组织:在使用之前和不同的样品之间,用70%乙醇冲洗剪刀或手术刀和镊子。将2-10 mg组织块放入溶液中。通过涡旋或移液彻底混合。确保组织浸没在溶液中。

    对于发干:
    在使用之前和不同的样品之间,用70%乙醇冲洗剪刀和镊子。剪去多余的发干,保留发根,将样品(根端向下)放入溶液中。每次提取只需要一根带根的发干。

    对于唾液:
    移取10 μL唾液到溶液中。通过涡旋或移液彻底混合。

    对于在卡片上干燥的唾液:
    将50 μL唾液吸移到收集卡上,并使卡片干燥。使用前和不同样品之间用70%乙醇冲洗打孔器。在卡上有干燥唾液样品的区域用打孔机冲下一片圆片(最好是1/8英寸或3 mm)。将圆片放入溶液中。在硬表面上轻敲管或板,以确保圆片在培养期间浸于溶液中。
     
  3. 在室温下孵育样品10分钟。
     
  4. 将样品在95°C孵育3分钟。

    注意:孵育结束时组织不会被完全消化。这是正常现象,不会影响性能。
     
  5. 向样品中加入100 μL中和溶液B,并涡旋混合。
     
  6. 将中和的组织提取物储存在4°C或立即用于PCR。继续第C部分第1步。

     注意:长期储存时,取出未消化的组织,或将提取物转移到新的试管或孔中。提取物现在可以在4°C下储存至少6个月,在大多数情况下没有明显的损失。

注意:第C部分第1步 — 长期储存时,取出未消化的组织,或将提取物转移到新的试管或孔中。提取物现在可以在4°C下储存至少6个月,在大多数情况下没有明显的损失。 B. 口腔拭子的DNA提取

  1. 收集拭子上口腔细胞,让拭子干燥。干燥时间约为10至15分钟。

    注意:由于用于DNA提取的溶液体积较小,应使用泡沫尖端拭子。应避免使用纤维尖端的拭子,如棉花或涤纶拭子,因为溶液无法有效回收。
     
  2. 移取200 μL提取溶液到1.5 ml微量离心管中。向管加入25 μL组织制备溶液,上下移液混合。

    注意:如果要进行多次提取,可以在使用前最多2小时以8:1的比例预先混合足量的提取和组织制备溶液。
     
  3. 将干燥的口腔拭子放入溶液中并在室温下孵育1分钟。
     
  4. 在溶液中转动拭子10次,然后将拭子转动着在管壁上抿,以从拭子中将多余的溶液挤出。丢弃拭子。盖上试管并短暂涡旋。
     
  5. 在室温下孵育样品10分钟。
     
  6. 将样品在95°C孵育3分钟。
     
  7. 向样品中加入200 μL中和溶液B,并涡旋混合。
     
  8. 将中和的提取物储存在4°C或立即用于PCR。继续第C部分第1步。

    注意:提取物可以在4°C下储存至少6个月,在大多数情况下没有明显的损失。

C. PCR扩增 REDExtract-N-Amp PCR反应混合物含有JumpStart Taq抗体,用于特定的热启动扩增。因此,PCR反应可以在室温下组装而没有过早的Taq DNA聚合酶活性。 典型的最终引物浓度约为0.4 μM。最佳引物浓度和循环参数取决于所使用的系统。

  1. 将以下试剂加入到薄壁PCR微量离心管或板中:

试剂 体积
水,PCR试剂 x μL
REDExtract-N-Amp PCR反应混合物 10 μL
正向引物 y μL
反向引物 y μL
组织提取物 4 μL*
总体积 20 μL

注意:REDExtract-N-Amp PCR反应混合物配方用于补充提取、组织制备和中和溶液中的成分。如果将少于4 μL的组织提取物添加到PCR反应物中,则按50:50的提取物:中和溶液B混合比例,使组织提取物的体积达到4 μL。
        2. 轻轻混合。
        3. 对于没有加热盖的热循环仪,在每个管的混合物顶部添加20 μL矿物油以防止蒸发。
        4. 进行热循环。应针对个体引物、模板和热循环仪优化扩增参数。

常用循环参数
步骤 温度 时间 循环数
初始变性 94 °C 3分钟 1
变性 94 °C 0.5-1分钟 30-35
退火 45 至 68 °C 0.5-1分钟
延伸 72 °C 1-2 分钟 (~ 1 kb/min)
最终延伸 72 °C 10分钟 1
最终保持 4 °C 无限  

        5. PCR完成后,扩增的DNA可以直接加载到琼脂糖凝胶上。没有必要添加单独的上样缓冲液 / 跟踪染料。
        注意:如果需要,可以对PCR产物进行纯化,用于下游应用,例如使用GenEluteTM PCR清除试剂盒 (货 号:NA1020)进行测序。  

 

 故障排除

 

问题 原因 解决方案
检测到很少或没有PCR产物







由于组织提取物中的污染物,PCR反应可能被抑制。 用50:50的提取溶液与中和溶液混合物稀释组织提取物。为了测试抑制,使用DNA对照和/或将已知量的模板(100-500个拷贝)与组织提取物一起加入PCR中。
提取物不够 将样品在55°C下而不是室温下孵育10分钟。
PCR组分可能缺失或降解。 运行阳性对照以确保组分功能正常。还建议在组装各个反应时使用核查表。
也许执行的循环数太少。 增加循环数(一次增加5-10个循环)。
退火温度可能太高。 以2-4°C的增量降低退火温度。
引物的设计可能不是最佳。 确认序列信息的准确性。如果引物长度小于22个核苷酸,则尝试加长引物至25-30个核苷酸。如果引物的GC含量低于45%,尝试重新设计GC含量为45-60%的引物。
变性温度可能太高或太低。 按1℃的增量增加或降低温度,以优化变性温度。
变性时间可能太长或太短。 按10秒的增量增加或缩短时间,以优化变性时间。
延伸时间可能太短。 按1分钟的增量增加延伸时间,尤其是对于长模板。
靶模板很困难。 在大多数情况下,靶样的固有困难是由于异常高的GC含量和/或二级结构造成的。据报道,在1.0-1.7 M的浓度下,甜菜碱(货号:B0300)有助于扩增高GC含量的模板。
多种产物 JumpStart Taq抗体无法正常工作 不要将DMSO或甲酰胺与REDExtract-N-Amp PCR反应混合物一起使用。它可以干扰酶-抗体复合物。其他助溶剂、溶质(例如盐)以及极端的pH值或其他反应条件,可能降低了JumpStart抗体对Taq聚合酶的亲和力,从而损害了它的有效性。
可能需要进行递减PCR。 “递减”PCR可显著提高各种应用中许多PCR反应的特异性。递减PCR包括在初始PCR循环期间使用高于引物TM的退火/延伸温度。然后在剩余的PCR循环中将退火/延伸温度降低至引物TM。可以在一个步骤中执行更改,也可以在几个周期内以一定增量执行更改。
阴性对照显示PCR产物或“假阳性”结果 试剂被污染 我们建议在每次PCR运行中使用不含DNA模板的试剂空白作为对照,以确定提取或PCR中使用的试剂是否被来自先前反应的模板污染。
孵育后组织未被消化。 组织本来就不会被完全消化。 REDExtract-N-Amp组织PCR试剂盒不要求组织被完全消化。不需完全消化组织即可释放足够的DNA用于PCR。
口腔拭子吸收了所有溶液 未使用推荐类型的拭子。 由于用于DNA提取的溶液体积较小,应使用泡沫尖端拭子。应避免使用纤维尖端的拭子,如棉花或涤纶拭子,因为溶液无法有效回收。

 

 材料

     

 参考文献

  1. Dieffenbach, C.W., and Dveksler, G.S. (Eds.), PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1995).
    Catalog Number Z364118
  2. Don, R.H. et al., ‘Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res., 19, 4008 (1991).
  3. Erlich, H.A. (Ed.), PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, New York (1989).
  4. Griffin, H.G., and Griffin, A.M. (Eds.), PCR Technology: Current Innovations, CRC Press, Boca Raton, FL (1994).
    Catalog Number Z357499
  5. Innis, M.A., et al., (Eds.), PCR Strategies, Academic Press, New York (1995).
    Catalog Number Z364452
  6. Innis, M., et al., (Eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, California (1990). Catalog Number P8177
  7. McPherson, M.J. et al., (Eds.), PCR 2: A Practical Approach, IRL Press, New York (1995).
    Catalog Number Z362387
  8. Newton, C.R. (Ed.), PCR: Essential Data, John Wiley & Sons, New York (1995).
  9. Roux, K.H. Optimization and Troubleshooting in PCR. PCR Methods Appl., 4, 5185-5194 (1995).
  10. Saiki, R., PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton, New York (1989).

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JumpStart and JumpStart Antibody are licensed under U.S. Patent No. 5,338,671 and 5,587,287 and corresponding patents in other countries.

GenElute, JumpStart and REDExtract-N-Amp are trademarks of Sigma-Aldrich Co. LLC.
REDTaq is a registered trademark of Sigma-Aldrich Co. LLC.