REDTaq™应用

by Brian Ward and Keming Song
Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA

简介

自推出以来,REDTaq一直深受科学界欢迎。其最初的产品理念是将上样缓冲液和染料也包含在反应体系内,从而提高PCR的便利性。最终产品将允许研究人员查看哪些样品含有酶并去除PCR后产物分析中的一个步骤,但不会妨碍任何扩增DNA可能的PCR后处理。产品名称REDTaq旨在向客户强调其简单易用。这种酶会以其他方式起到类似于Taq聚合酶的作用,但可以显色。

 

试剂

 

日常Taq 与基因组DNA或复杂模板配套使用的Taq
不含热启动抗体 含热启动抗体 含MgCl2 单独的MgCl2
含MgCl2 含一管dNTP 不含dNTP 不含dNTP
REDTaq® DNA聚合酶 (D4309) JumpStart™REDTaq® DNA聚合酶 (D8187) REDTaq® perPak™ DNA聚合酶 (D6063) REDTaq® 基因组DNA聚合酶,含MgCl2 (D8312) REDTaq® 基因组DNA聚合酶,不含MgCl2 (D2812)
 
Readymixes-含缓冲液和dNTP的预混合PCR试剂 高保真校对Taq
不含热启动抗体 含热启动抗体 不含热启动抗体 含热启动抗体
高[Taq] 低[Taq]
REDTaq® ReadyMix™ PCR反应混合物 (R2523) JumpStart™ REDTaq®ReadyMix™
(P0982)
JumpStart™
REDTaq®
ReadyMix™
(P1107)
REDAccuTaq® LA DNA聚合酶 (D4812) JumpStart™REDAccuTaq® LA DNA聚合酶 (D1313)

 

结果和讨论

REDTaq 用于下游应用
从无数可能实现上述目标的发色团中选择一种效果媲美我们的标准Taq DNA聚合酶的扩增系统。筛选过程考虑到了PCR和PCR后处理问题,例如PCR毒性、PCR产物纯化方法、限制酶切消化、连接和转化。最严格的筛选测试之一是PCR产量。从图1可以看出,新配制产品的PCR产量与Taq相当。另外,REDTaq反应混合物的PCR产物还可用于自动测序,不会引起荧光伪影,也不会阻碍测序反应或读取长度。REDTaq的一个意外好处是,实验人员可以很容易地看出反应是否充分混合了。总而言之,REDTaq的性能与我们最初设想的相同。除了可视化和直接上样的额外便利之外,添加剂对反应没有任何影响。

REDTaq在长距离和热启动PCR中的相容性
自REDTaq初始制剂问世以来,我们发现该制剂在以PCR混合物形式储存时完全呈惰性,因而最近推出了REDTaq ReadyMixes。只要对初始制剂略微加以优化,即可与Taq混合物(AccuTaqTM)和Taq定向抗体(JumpStartTM)相容。在图2中,当模板量较少时,通过比较含有和不含抗体的REDTaq的效果,揭示了REDTaq与热启动抗体的相容性。

 

 

图1. 使用REDTaq和Taq DNA聚合酶得到的相对PCR产物产量是靶序列长度的函数。产物产量可以含有[32P] dCTP的PCR的酸不溶性计数进行定量。将产量归一化为Taq DNA聚合酶的产量。使用λ噬菌体DNA作为模板进行反应,平行两份。产物质量通过平行非放射性PCR的琼脂糖凝胶电泳进行独立检查。

图2. 含和不含热启动抗体的REDTaq。用小麦总基因组DNA进行的PCR反应:400 bp靶扩增子。开始反应,扩增前室温孵育2小时。泳道1含有标志物。泳道2-3显示使用0.4 ng总模板和REDTaq DNA聚合酶的重复PCR。泳道4-5显示使用JumpStart REDTaq DNA聚合酶的平行两份的相同反应的产量。

 


Optimizing REDTaq PCR


由于REDTaq与Taq的性能基本相同,因此REDTaq和Taq PCR优化在操作上也是相同的。但是,REDTaq对镁的要求不同于Taq。虽然优化REDTaq和Taq的镁浓度的方法相同,但实验人员应该意识到,即使所有其他参数(模板、引物循环条件等)相同,针对Taqmay优化的镁浓度对于REDTaq而言并不是最佳的。PCR优化通常可以通过改变以下中的一个或多个参数(按重要性顺序)来实现:模板质量、引物设计、循环参数和镁浓度。有许多优秀的综述涉及PCR优化,1,2大多数优秀的技术图书馆包括最新的书籍,涵盖了通用的PCR技术。3,4通过改变前面描述的一个或多个参数,可以完成大多数复杂的PCR工作。然而,这远非PCR优化的通用方法。如果模板质量足够好,那么问题通常在于PCR退火的复杂性,其是熔化温度(Tm)的函数。Tm是引物:模板复合物的退火速率和解离速率相等时的温度。

解离是单分子反应,与浓度无关,而退火是双分子反应,取决于PCR产物和引物浓度。简而言之,在PCR期间,Tm值会发生变化。“降落”PCR技术允许Tm计算存在一定误差。5在该方法中,退火温度需比Tm计算值高5至10度。后续循环的退火温度在循环过程中缓慢下降。降落PCR要求预扩增步骤在尽可能最严格的退火条件下进行,后续较不严格的扩增依赖于正确扩增子的质量作用,从而超过任何副产物。这种策略很有用,因为它是一种普遍使用的扩增手段。在阳性对照实验证明PCR试剂没有问题后,值得尝试。

 

图3. 大片段人基因组DNA和λ DNA的扩增。泳道1-3:人基因组DNA 5、10和20 kb片段的JumpStart REDAccuTaq LA扩增;泳道4:20kb λ DNA的扩增。泳道5-8与1-4相同,但使用的是竞争对手的长而准确的酶混合物。泳道9为10、8、6、5、4、3、2.5、2、1.5和1.0 kb(1 kb阶梯)的标志物。开始反应,室温温育2小时,然后进行相同的循环步骤。

 

结论

含有优化反应缓冲液的REDTaq DNA聚合酶性能相同,在绝大多数应用中可直接替代Taq DNA聚合酶。不同之处是PCR很麻烦。当使用非标准镁浓度时,两者的差异就会成为一个问题。

 

材料

     

   

参考文献

  1. Linz, U., Protocol optimization and the need for standardization of the polymerase chain reaction. Meth. Mol. Cell. Biol., 2, 98-102 (1991).
  2. Roux, K. H., Optimizing and troubleshooting in PCR. PCR Methods Appl., 4, S185-94 (1995).
  3. Innis M. A and Gelfand, D. H, PCR protocols: a guide to methods and applications, pp. 3-20, (Academic Press, New York, 1990).
  4. Powell, S. J., PCR: essential data, pp. 72-86 (Wiley & Sons, New York, 1995).
  5. Don, R. H. et al., ‘Touchdown’ PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucl. Acid Res., 19, 4008 (1991). REDTaq , JumpStart, AccuTaq and JumpStart REDAccuTaq are trademarks of the Sigma-Aldrich Corporation.