用工程质粒转化大肠杆菌

 制作感受态细胞(Inoue法)

Inoue及其同事在1990年开发了这种方法,它非常适用于克隆中常用的许多菌株。最初的方法要求在18℃下培养过夜的大肠杆菌培养物。我们发现,如果在37°C下生长过夜,它们仍然可以正常工作。或者,您可以购买即用型化学感受态细胞或电感受态细胞,包括BL21(货号:CMC0014)和SIG10(货号:CMC0001)。商购的现成感受态细胞具有优势,因为它们的制备已经过优化,为独特应用提供具有高转化效率的特化细胞。完整的产品目录,请参见感受态细胞选择指南

您将需要:

DMSO(二甲基亚砜)(货号:D8418
用于培养大肠杆菌的LB板
用于培养过夜培养物的3 × 250 mlSOB(货号:H8032
用作起子培养物的额外SOB
震动培养箱
0.5 M PIPES(哌嗪-1,2-双[2-乙磺酸])pH 6.7(货号:P8203
Inoue转化缓冲液
无菌微量离心管
无菌离心管,容量至少250 ml
能够以2,500 × g的力旋转这种管的离心机
 

热休克感受态细胞生产实验方案

第1天

  1. 从已孵育过夜的LB板中挑选单个大肠杆菌菌落。在含有菌落的50 ml管中接种2 ml SOB培养基的起子培养物,并在37℃下震动孵育约7小时。
  2. 制备或解冻Inoue转化缓冲液的等分试样。
  3. 接种含有250 ml SOB培养基和三种不同体积的起子培养物的三个烧瓶,以确保其中一个在第二天早晨达到所需的OD。我们建议尝试10 μl、50 μl和250 μl。将烧瓶在37℃下震动孵育过夜。

第2天

  1.  第二天早上读取所有三种培养物的OD600。继续监测OD600。
  2. 当其中一种培养物的OD600达到0.55时,将该培养物转移到冰水浴中10分钟。  (开始冷却微量离心管。)
  3. 2,500 x g、4℃离心10分钟收获细胞。
  4. 倒掉上清液,将细胞转移到80 ml冰冷的Inoue转化缓冲液中轻轻重悬细胞。
  5. 2,500 x g、4℃离心10分钟回收细胞。
  6. 倒掉上清液,将细胞移液到10 ml冰冷的Inoue转化缓冲液中轻轻重悬细胞。
  7. 加入0.75 ml DMSO,旋转混合,将细胞在冰上静置10分钟。
  8. 将100 μl等分的细胞悬液分配到冰冷的微量离心管中。
  9. 将等分的感受态细胞分批放入液氮中快速冷冻。

将等分试样储存在-80°C冰箱中直至需要。

 制作琼脂板

该配方设计用于制备约50-60个Luria-Bertani(LB)琼脂板,用于用标准质粒培养大肠杆菌。或者,您可以购买预先测量的EZ-Mix™ 款式的LB琼脂(货号:L7533)。

10 g 胰蛋白胨 (货号:T2559)
5 g 酵母提取物 (货号:Y1625Y1626)
10 g NaCl (货号:S3014)
15 g 琼脂粉 (货号:L2897)
用水定容至1升

量出上面的量,添加到带有良好工作盖的1升的瓶子(见下文)。加入干净的去离子水(理想情况下至少18兆欧)。拧紧盖子,摇动混合液体和粉末,不要希望完全溶解,但只要瓶底没有粉末,且液体里没有成团粉末就行。如果没有适当混合,瓶底粉末可能会被烤干。拧松盖子约半圈,缠上高温高压灭菌带,然后高温高压灭菌。

高温高压灭菌后,确保盖子完全拧紧,请勿冷却到45-50度以下。琼脂通常会在40度左右凝固。我们的经验是,如果拿起来不烫手,即可以倒出了,而且实际可能已经太凉了。当琼脂太热时,请勿添加抗生素,否则会影响抗生素的稳定性和半衰期,特别是氨苄西林。加入适量的抗生素(见下文),轻轻旋转混合。避免有气泡,因为这会导致培养板含有气泡或不均匀。每个板大约浇注12-15 ml(货号:Z617636)。一种简单的方法是将板子摞起来,大的截面(盖子)竖起来。拿着最底下那块板的盖子将摞在一起的所有板子提起来,用另一只手倒琼脂。倒入足够充满底部的量,然后再多倒一点。然后将这摞板放下,然后拿着这摞板的第二个盖子将这摞板子提起进行浇注。这样做看起来很不均匀,但随着时间推移,这其实非常可再现。

或者,您可以购买含有或不含抗生素的现成的LB琼脂板:

LB琼脂板 (货号:L5542)
含氨苄青霉素的LB琼脂板 (货号:L5667)
含卡那霉素的LB琼脂板 (货号:L0543)
含羧苄青霉素的LB琼脂板 (货号:L0418)
含四环素的LB琼脂板 (货号:L8795)

提示1:许多实验室瓶子都有蓝色或透明的塑料突边,它们有可能缺失或被火烧焦。当浇注板时,这些蓝色突边防止琼脂从瓶壁流下,并在高温高压灭菌后保持气密。确保突边完好无损。

提示2:1升是相当多的琼脂和抗生素,可按您的需要缩小配方。我一般每次制作0.5升(约30个板)。

抗生素浓度:

在水中制备原液:每1 ml培养基添加1 µl
卡那霉素 (货号:K4000) — 原液50 mg/ml,终浓度50µg/ml
氨苄青霉素 (货号:A9518) — 原液100mg/ml,终浓度100 µg/ml
链霉素 (货号:S6501) — 原液50mg/ml,终浓度50 µg/ml
壮观霉素 (货号:S9007) — 原液100mg/ml,终浓度100 µg/ml

在乙醇中制备原液:每ml培养基添加5 µl
氯霉素 (货号:C0378) — 原液34 mg/ml,终浓度170 µg/ml
四环素HCL (货号:)87128 — 原液10 mg/ml,终浓度50 µg/ml


 细菌转化

将DNA导入细菌的最简单方法是热休克和电穿孔。热休克的原理正如其名,是用热使细菌休克。如果不能造成休克,则不起作用,因此之前必须保证细菌是冷的。这个要求怎么强调都不过分。当细菌从冷变热时,它的细胞膜上会形成孔,从而使DNA进入细胞。电穿孔的原理类似,但只是用电打孔。这些过程均是模仿或至少基于细菌的自然能力过程。通常,电穿孔产生更多的菌落,但并非总是如此。对于大多数DNA克隆应用,热休克都好用。

细菌转化热休克实验方案(常用方法)

  1.  每次在冰上进行DNA /连接反应或对照反应,都解冻一管预制的感受态细胞,并将管深深地推进冰里。解冻需要大约5-10分钟。保持细胞尽可能冷,避免手接触到管内装着细胞的那部分管身,即使少量的热量也会影响转化过程。
  2. 在冰上预冷15 ml Falcon管(货号:SIAL0791),将3-4 μl连接反应物(或对照反应物)转移到每个管中。
  3. 在每个连接反应中加入95 μl感受态细胞,在冰上至少孵育20分钟。更长时间没问题,但我们只测试了最长至45分钟。
  4. 在加热块或水浴中在42°C下热休克90秒。
  5. 然后加入1 ml不含抗生素的LB肉汤(货号:L3022L2542、或L3522)或者SOC培养基(货号:S1797),并将细胞在37℃、227 RPM的培养摇床中孵育1小时。
  6. 将含有转化后的感受态细胞的所有LB倒在含有正确抗生素的琼脂板上。
  7. 将板竖直放置于1级罩内或者37°C培养箱中,盖子微启,晾干约5-10分钟。请勿在用于哺乳动物组织培养的罩子中执行这一操作。您的同事会不高兴的。请勿让板干燥时间过长,否则有些细菌可能会死亡。
  8. 将板在37°C孵育过夜。即将出现的菌落来自单个转化细胞,并且由于存在质粒而对抗生素具有抗性。每个菌落将包含数同一个细胞的百万个相同拷贝,因此称为克隆。

细菌转化热休克实验方案(其他方法)

  1. 每次在冰上进行DNA /连接反应或对照反应,都解冻一管预制的感受态细胞,并将管深深地推进冰里。不要只是把管放在冰上或冰中,而是使管尽可能地冷。解冻需要大约5-10分钟。避免手接触到管内装着细胞的那部分管身,即使少量的热量也会大大影响转化过程。
  2. 向100 μl感受态细胞中加入2-5 μl每种连接反应物(或对照反应物)。将混合物移出时,要用吸吸头非常快速地搅动。请勿上下移液。尖端可能处于室温,因此应尽快将其拿出来。
  3. 在冰上孵育至少15分钟。更长时间没问题,但我们只测试了最长至45分钟。
  4. 在加热块或水浴中在37°C下热休克3分钟。
  5. 然后加入1 ml不含抗生素的LB培养基(货号:L3522L2542L3022),并在37℃下将细胞再孵育15分钟。
  6. 将含有转化后的感受态细胞的所有LB倒在含有正确抗生素的琼脂板上。
  7. 将板竖直放置于1级罩内或者37°C培养箱中,盖子微启,晾干约5-10分钟。请勿在用于哺乳动物组织培养的罩子中执行这一操作。您的同事会不高兴的。重新盖上盖子,当平板接近干燥时,将其翻过来。请勿让板干燥时间过长,否则有些细菌可能会随琼脂干燥而死亡,而你最终得到的是一张非常薄的琼脂片!
  8. 将板在37°C孵育过夜。即将出现的菌落来自单个转化细胞,并且由于存在质粒而对抗生素具有抗性。每个菌落将包含数同一个细胞的百万个相同拷贝,因此称为克隆。
     

 挑选细菌菌落

这个步骤很简单,因此不需要单独出一份实验方案,但鉴于它是整个过程的一个重要部分,我们在这里简单描述一下。

在进行了有适当对照的转化之后,您应该有三个细菌板。如果一切都正确,您应该在连接板上有很多菌落,而在没有片段但有连接酶的板上有较少的菌落(或没有菌落),在没有片段和连接酶的板上菌落会更少(或没有菌落)。在对照板上背景通常相当高,这并不一定意味着连接没起作用,只要在连接板上有更多的菌落就行。挑选用于进一步筛选的菌落的个数,由对照板(在反应物中有连接酶)的菌落数与连接板上菌落数的比率决定。

例如,如果连接板上的菌落数比对照板多10倍,那么理论上(如果您正在进行标准的粘性末端定向克隆)您所挑选的10个菌落中有9个会将正确的片段连接到其中(由于多聚体或多联体等,这通常不会成为现实)。在这种情况下,挑选5-10个菌落应该绰绰有余。

如果与对照板相比,在连接板上只有两倍多的菌落,则最好挑选10个或更多菌落。可以将板放入冰箱中,如果需要可以挑选更多的菌落。在挑选菌落时不要过于冲动,挑选50只是浪费时间,除非您正在做一个非常困难的连接。

如果板之间没有差异,则说明反应失败。在这种情况下,不必再麻烦挑选菌落了。重复前面的步骤,尝试通过消化更长时间、去磷酸化更长时间、暴露于更少的紫外线、或尝试其他酶来减少背景。酶干脆无效是常事。

挑选菌落实验方案

  1. 将板从37ºC培养箱中取出后,将它们倒扣(即它们在培养箱中的放置方向)在工作台面上。
  2. 使用移液器或类似仪器,将含有正确浓度抗生素的3-5 ml LB培养基(货号:L3522L2542、或L3022)移液到无菌25 ml或50 ml试管中(试管数量取决于您想要培养的数量)或类似的带螺旋盖的管,并给它们贴上标签。细菌培养物与管中空气量的体积-体积比,对于确保细菌生长至足够密度是很重要的,类似说明书从来不会要求液体与空气之比低于1:3,但最好更高些。
  3. 一只手拿着无菌移液器吸头靠近移液器的一端,另一只手拿起倒扣着的含有连接步骤生成的细菌的板。用手将板翻过来让细菌面朝上朝向您,然后用移液器吸头尖轻轻接触完全与任何其他菌落分离的菌落。
  4. 现在将粘有细菌的同一个吸头放入含有LB培养基的试管(来自步骤2)中的一个中,并稍微移动一下吸头,以使一些细菌释放到液体中。有些人只是将移液器吸头弹射到培养基中,但如果这样做,第二天需要把它拿出来。
  5. 在摇床中,37℃、190-225 rpm孵育这些试管过夜。

注意:上述程序应使用无菌技术进行。理想情况下,靠近本生灯进行,如果没有,1级罩就足够了。实际上,与其担心外部细菌污染样品(因为它们的污染机会很少,除非它们来自您之前在工作台上进行的其他实验),可能更值得注意的是每个样品间不要有交叉污染,因为您在同一种抗生素中培养所有这些样品。


 冷冻细菌菌落

作为液体培养物生长的细菌菌落可以在4℃下保存几周而不会变质。任何已确认包含您的插入物的克隆,都应存储起来供长期使用。最常用的克隆储存方法是冷冻甘油原液。对于室温下的替代品(特别适用于较大的样品数量),请考虑Biomatrica的CloneStable产品(货号:93121-017)所使用的新技术。

甘油原液实验方案

  1. 将5 ml甘油(货号:G5516)与5 ml蒸馏无菌水混合,制备50%甘油原液。充分混合。
  2. 对于每个要存储的菌落,将500 μl过夜培养物与500 μl 50%甘油溶液混合。充分混合,并分装到2 ml冷冻管中。
  3. 储存在-80°C。