限制酶消化实验方案

分子生物学指南里可以找到更多的实验方案与指南。

Sigma® Life Science的限制酶系列产品已经过优化,可使用五种独特的缓冲液进行消化。当使用单一酶消化DNA时,请使用与酶一起提供的缓冲液(亦可在限制酶缓冲液参考表1上找到)。
 

 用单一限制酶进行DNA消化的实验方案

  1. 按照显示的顺序将组分添加到干净的试管中:
         1 μL DNA(浓度1 μg/μL)
         2 μL10x缓冲液
         1 μL限制酶
         16 μL无菌水
  2. 在消化温度(通常37°C)下孵育反应物1小时。
  3. 通过热灭活(65℃,15分钟)或加入10 mM终浓度的EDTA终止消化。
  4. 消化的DNA即可用于研究应用。
当一次使用两种限制酶时,首先使用限制酶缓冲液参考中的表格检查每种缓冲液中的酶活性。如果它们在同一缓冲液中都具有100%活性,则可以使用该缓冲液继续进行双重消化实验方案。否则,从常用双重消化表中确定最佳缓冲液。在某些情况下,由于缓冲液不相容(成分或温度),建议进行连续消化。
 

 用两种限制酶进行DNA消化的实验方案

  1.  按照显示的顺序将组分添加到干净的试管中:
         1 μL DNA(浓度1 μg/μL)
         2 μL10x缓冲液
         1 μL每种限制酶
         15 μL无菌水    
  2.  在消化温度(通常37°C)下孵育反应物1小时。
  3. 通过热灭活(65℃,15分钟)或加入10 mM终浓度的EDTA终止消化。
  4. 消化的DNA即可用于研究应用。

 连续DNA消化的实验方案

  1. 按照显示的顺序将组分添加到干净的试管中:
         1 μL DNA(浓度1 μg/μL)
         2 μL10x缓冲液
         1 μL限制酶
         16 μL无菌水
  2. 在消化温度(通常37°C)下孵育反应物1小时。
  3. 通过热灭活(65℃,15分钟)或加入10 mM终浓度的EDTA终止消化。
  4.  使用纯化试剂盒回收DNA:重悬DNA,并将其稀释至1 μg/μL。
  5. 按照步骤1准备第二次消化,继续执行到步骤3。
  6. 消化的DNA即可用于研究应用。