冷冻细胞系的复苏

细胞培养实验室基础技术手册 - 第2版

 目标

冷冻细胞系的复苏

从培养物典藏(例如ECACC)获得的许多培养物是以冷冻形式供货的,为了使用细胞,必须将它们解冻并放入培养基。必须以正确方式解冻细胞,才能保持培养物的活力,并使培养物更快恢复。一些冷冻保护剂,如DMSO,在4°C以上是有毒的,因此必须快速解冻培养物,并在培养基中稀释,以尽量减少毒性作用。


 材料

  • 培养基 — 预热到适当的温度(有关正确的培养基和温度,请参阅ECACC细胞系数据表。)
  • 70%(v/v)异丙醇,溶于无菌水中
  • DMSO
  • Tryan蓝(活体染剂)

 设备

  • 个人防护装备(无菌手套、实验室外套、护目镜)
  • 运输冷冻安瓿瓶的容器,例如装着干冰或液氮杜瓦瓶的箱子。
  • 设置到适当温度的水浴
  • 适当密封水平的微生物安全柜
  • 培养箱
  • 预先标记的烧瓶
  • 倒置相差显微镜
  • 血球计数器
  • 离心机
  • 标记笔
  • 移液管
  • 安瓿瓶架
  • 纸巾

 操作步骤

  1. 阅读细胞系数据表以确定细胞系的特定要求。
  2. 准备烧瓶 — 贴上标注了细胞系名称、传代号和日期的标签。
  3. 佩戴适当的个人防护装备,从液氮储存箱中取出一安瓿瓶细胞,并放入液氮容器或干冰上转移到实验室。在处理安瓿瓶时请务必小心:在极少数情况下,瓶中残留的液氮遇热膨胀,可能会造成安瓿爆炸。
  4. 在微生物安全柜中,将浸透了70%酒精的纸巾包裹在冷冻安瓿瓶盖的四周,然后转动盖子四分之一圈,以释放可能残留的液氮。重新拧紧盖子。将安瓿瓶快速转移到37°C的水浴中,直至只剩下一到两个小冰晶,如果还有更多冰晶,则多待1-2分钟。必须快速解冻,以最大限度地减少对细胞膜的任何损害。注意:请勿完全浸没安瓿瓶,否则会增加污染的风险。
  5. 在打开安瓿瓶之前,用浸透了70%酒精的纸巾擦拭安瓿瓶。
  6. 将安瓿瓶中的全部内容物移液至无菌管(例如15 ml容量的管)中。然后慢慢加入5 ml预热的培养基,培养基中已经补充了适当的成分。确定活细胞密度(参见第49页的实验方案6 — 细胞定量)。将适当体积的细胞悬液转移至烧瓶中,以达到细胞系数据表中建议的细胞接种密度。

    对于贴壁细胞系:
    调整培养基的体积,如有必要,调整培养瓶的大小,以达到细胞系数据表中建议的细胞接种密度。通常不需要进行预离心步骤去除冷冻保护剂,因为第一次更换培养基将能除去残留的冷冻保护剂。如果需要预离心,数据表上会特别指明。如果要立即使用细胞(例如用于基于细胞的测定),而不是传代培养,则建议进行预离心步骤以除去冷冻保护剂。

    对于悬浮细胞系:
    建议进行预离心步骤除去冷冻保护剂,即150 × g离心5分钟使细胞沉淀,然后用适当体积的新鲜培养基重悬细胞以获得正确的接种密度。
  7. 以数据表中建议的温度和CO2水平进行孵育。如果使用有CO2进气的培养箱,则烧瓶应具有通气盖以允许气体交换。
  8. 24小时后用(相差)显微镜检查细胞,并视需要进行传代培养。

 重点

  1. 大多数教科书建议在培养基中清洗解冻的细胞以除去冷冻保护剂。仅在已知冷冻保护剂对特定细胞类型具有不利影响时才需要这样做。例如,已知一些细胞类型在DMSO存在下分化。在这种情况下,细胞应在加入其最终培养瓶中之前在培养基中洗涤。
  2. 将解冻的细胞悬液加入培养基中能有效稀释冷冻保护剂(例如DMSO),降低冷冻保护剂的毒性。这就是为什么必须在安瓿瓶解冻后立即将解冻的细胞悬液加入到较大体积的培养基中。请勿让解冻的安瓿瓶长时间在室温下放置。
  3. 请勿使用培养箱或手掌解冻细胞培养物,因为解冻速度太慢会导致活力丧失。使用上述实验方案中所述的水浴。
  4. 如果没有CO2培养箱,则向烧瓶充经过0.2 μm过滤器过滤的含有5% CO2和95%空气的气体1-2分钟。
  5. 对于大多数培养物,最好的做法是在达到汇合之前进行传代培养,以便在其生长的对数期收获细胞,这时的细胞处于最佳生存状态,适于接种到新的烧瓶中。此外,存在一些特定的细胞类型,在达到汇合之前必须进行传代培养以保持其特征,例如如果让NIH 3T3细胞反复达到汇合,那么它们的接触抑制作用会丧失。
  6. 一些杂交瘤细胞在复苏后可能恢复缓慢,因此开始时应在适当的培养基中添加20%(v/v)FBS和10%(v/v)杂交瘤增强补剂。
 

 材料