逆转录实验方案(一步法SYBR Green I染料检测)

逆转录

逆转录(RT)是指使用逆转录酶和dNTP将RNA转化为cDNA的过程。

该过程既可对总RNA进行RT步骤,从而产生代表样品中所有RNA转录本的整体cDNA(通常通过两步法),也可通过基因特异性方法,仅将目标RNA转化为cDNA(通常遵循一步法)。

下述实验可用作RT基础实验方案,供研究人员对其进行修改以满足特定要求。通常使用两步法制备cDNA,随后在加入PCR / qPCR体系之前对cDNA进行稀释,或者通过一步法反应进行制备,依次进行两个过程。

设备

  • 定量PCR仪
  • 用于RT-qPCR设置的层流罩(可选)

 

试剂

  • RNA(约1μg/μL储存液)
  • SYBR Green 定量RT-PCR试剂盒kit (Sigma QR0100)
  • PCR级水:PCR级水(W1754或W4502),20mL等分试样;冻存;每次反应均使用新鲜的等分试样。
  • 正向和反向PCR引物(10μM工作原液):
  • 可以在sigma.com/oligos上订购定制寡核苷酸。
 
仪器 最终参比染料浓度 参比染料体积(μL;每20μL反应)
Applied Biosystems 5700 0.2
Applied Biosystems 7000 0.2
Applied Biosystems 7300 0.2
Applied Biosystems 7500 0.1× 0.02
Applied Biosystems 7500 Fast 0.1× 0.02
Applied Biosystems 7700 0.2
Applied Biosystems 7900 0.2
Applied Biosystems 7900 HT Fast 0.2
Applied Biosystems 7900HT 0.2
Applied Biosystems StepOnePlus™ 0.2
Applied Biosystems StepOne™ 0.2
Applied Biosystems ViiA 7 0.1× 0.2
Bio-Rad CFX384™ 未用 -
Bio-Rad CFX96™ 未用 -
Bio-Rad MiniOpticon™ 未用 -
Bio-Rad/MJ Chromo4™ 未用 -
Bio-Rad/MJ Opticon 2 未用 -
Bio-Rad/MJ Opticon™ 未用 -
Cepheid SmartCycler® 未用 -
Eppendorf Mastercycler® ep realplex 未用 -
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s 未用 -
Illumina Eco qPCR 未用 -
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000 未用 -
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000 未用 -
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q 未用 -
Roche LightCycler® 480 未用 -
Stratagene Mx3000P® 0.1X 0.02
Stratagene Mx3005P™ 0.1X 0.02
Stratagene Mx4000™ 0.1X 0.02

 

实验用品

 

方法

在下面给出的实验案例中,研究人员可以根据优化实验的结果对引物浓度进行调节 (参见 引物浓度优化温度梯度法引物优化  和 检测方法优化和验证章节)。

1.    将试剂盒组分和RNA样品置于冰上。

2.    混合然后短暂离心以收集管底部的内容物。

3.    为每个反应和对照准备一份预混液,并根据表P11-28,额外添加10%的RT酶以允许移液误差。

4.    为每个对照组准备一个预混液,并根据表P11-28,额外添加10%的PCR级水(而非RT酶)代替酶以允许移液误差。

 

表P11-28. 用于一步法SYBR Green I RT-PCR反应的预混液。

试剂 每25μL反应所需体积(μL)
2×SYBR Green定量RT-PCR缓冲液,Sigma QR0100 12.5
仪器特定参比染料(可选),见表P4-7 0.025
正向引物 F (10 μM) 1.125
反向引物 R (10 μM) 1.125
PCR 级水 9.1
MMLV RT 酶 0.125

 

5.    向每个PCR管中加入1μL总RNA(每次反应250-2500ng)。如果使用PCR孔板,请按照平板示意图确保将反应混合物、样品和对照添加至正确的孔中。

6.    向每个孔中加入24μL 预混液,将无RT混合物添加至负RT对照样品中。

7.    密封每个反应或孔板后,轻轻涡旋以混合内容物。

8.    短暂离心以收集反应管底部的组分。

9.    根据表P11-29设置实时qPCR。

 

表P11-29. 用于一步法SYBR Green I RT-qPCR的RT PCR循环参数。

循环条件 温度 (°C) 时间
第一链合成 42–44 30 min
变性/ RT失活 94 30 sec
步骤1-3重复40个循环
步骤 1 95 5 sec
步骤 2 55 15 sec
步骤 3 72 10 sec

 

10.    进行反应后熔融分析。

 

材料