使用ReadyScript cDNA合成 (RDRT)混合物进行逆转录

操作步骤

制备

将组分放于冰上。混合,然后短暂离心收集管底部的内容物

 

试剂 20 μL反应体系所需体积 终浓度
ReadyScript cDNA合成混合物(RDRT) 4 μL 1X
RNA模板 体积可变 总RNA为1μg至10 pg
不含RNA酶/DNA酶水 体积可变  
总体积 20 μL  

注:反应体积更小或更大时,组分可按比例缩小或按比例增加。

 

反应

  • 将试剂加入0.2-mL微型离心管或96孔板中,并置于冰上。
  • 封口各反应物,轻轻涡旋以混合内容物。短暂离心,收集反应管底组分。
  • 孵育:
    • 30分钟,42 °C
    • 5 分钟,85 °C
    • 4 °C保温
  • 完成cDNA合成后,使用第一链反应的1/5至1/10(2-4μL)进行PCR扩增。如果需要,可以用10 mM Tris-HCl(pH8.0),0.1 mM EDTA稀释cDNA产物并储存在-20℃。

 

逆转录指南—qPCRMinus RT对照:

RT-qPCR精确定量基因表达需要针对每个目标基因,对每份RNA样品中的基因组DNA污染进行定量。痕量gDNA存在通常不会干扰高拷贝数参考基因定量,但可对低拷贝数基因信号产生显著影响。即使使用由内含子序列或桥接外显子连接分开的引物,基因组DNA的存在也可以通过假基因或脱靶PCR产物的扩增而产生阳性信号。因此,在实验设计中始终包含适当的“无RT”或“阴性RT”对照反应十分重要。

由于逆转录酶是ReadyScript cDNA合成混合物的组成组分,因此单独构建不含RT的合成混合物作为对照是不可行的。检测基因组DNA存在的最直接方法是绕过RT步骤并直接使用等量RNA制备物进行PCR扩增。例如:如果您从1μg总RNA开始进行cDNA合成,并使用1/10的第一链反应产物作为qPCR模板;然后使用100 ng总RNA作为阴性RT对照qPCR模板。在仅有RNA的对照组中,任何信号都可作为存在基因组DNA的依据。


总RNA的DNA酶消化:

如果痕量水平的基因组DNA干扰了靶标基因准确定量,请使用高质量、无RNase的DNase I制剂去除残留基因组DNA(DNAse I,货号AMPD1-1KT)。在DNase酶消化后,必须在进行第一链合成前去除所有痕量DNase酶活性。适宜的RNA纯化方法包括苯酚:氯仿提取,乙醇沉淀,或离液盐和基于二氧化硅的RNA纯化管或柱(GenElute TM Direct mRNA Miniprep试剂盒,货号DMN10)。简单的“加热杀菌”步骤或灭活浆状溶液与ReadyScript cDNA 合成混合物不兼容。

 

材料

     

ReadyScript为Sigma-Aldrich Co. LLC的注册商标
GenElute为Sigma-Aldrich Co. LLC的商标