NBT实验方案和故障排除

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 实验方案

可与BM Purple(通常为NBT/BCIP)联用的复染剂

有几种复染剂能和BM Purple(通常为NBT/BCIP)联用,包括FastGreen FCF和Nuclear Fast Red。

原位杂交NBT/BCIP或Fast Red偏好底物推荐

当进行双标记实验时,Fast Red可用于高表达基因。如需更多NBT/BCIPFast Red双标记结合其它荧光底物的相关信息,请访问http://www-biology.ucsd.edu/~davek/intro.html

使用NBT/BCIP荧光显微镜ISH检测:

NBT/BCIP切片染色经常在光镜下观察。根据使用的复染剂,你还可以使用带有UV光源的显微镜检测信号。使用暗视野照明也能轻松观察到非常微弱的信号。

请注意NBT/BCIP不是一种荧光沉淀,不像Fast Red染料那样可以吸收和发射特殊波长光。如果你想用荧光信号,要用DIG/AP结合ECF底物系统,而不是NBT/BCIP。

显色反应过夜:

将显色反应留过夜是较常见的比较方便的做法。是否需要更长时间取决于探针和组织类型。首先根据经验判断一下,过夜培养是否使用于你的特异性探针和组织。反应后冲洗效果好也是很重要的。当进行过夜显色反应时,要确保你的染色缸密封,放置在黑暗中。NBT/BCIP对空气敏感,在有气泡时,会形成非特异性沉淀。一定要检查缸内玻片间是否有气泡,小心地去除气泡。

ISH中使用过期的NBT/BCIP效果:

当NBT/BCIP过期后,它的灵敏度可能降低,无法进行ISH检测。请准备新鲜的NBT和BCIP,以保证最高的检测灵敏度。

推荐结合抗-DIG-AP检测/NBT/BCIP非放射原位杂交复染剂

众所周知,NBT/BCIP和经典的复染剂不兼容。NBT/BCIP信号不能用含有二甲苯的固封剂,比如DPX来封片,因为这会形成颜色结晶沉淀。然而,经典的复染剂,比如伊红需要含有二甲苯的固封剂。

以下固封剂专门用于NBT/BCIP信号封片:Biomedia公司的Crystalmount或Vector实验室的Vectamount或Immunomount。同一家共提供的有机复染剂和固封剂通常也可以兼容(比如Vector甲基绿,Vector核Fast Red)。某种特定复染剂和某一固封剂结合的结果主要取决于NBT/BCIP显色检验的组织类型。

使用一种典型复染剂给邻近的含有或者不含有NBT/BCIP的切片都染上色,然后用经典的含二甲苯固封剂封片。这样就能直接比较被染色的组织有还是没有信号
 

客户推荐制备固封剂实验方案:

甘油明胶:

  • 100ml,0.2M磷酸缓冲液,pH7;
  • 200mg叠氮化钠;
  • 15g明胶,搅拌至完全溶解;
  • 100ml甘油。

37℃保存,在载玻片和盖玻片上滴上一滴。固封剂变硬后,信号能够保持几年,不会发生NBT/BCIP沉淀淬灭。

*:客户推荐实验方案是客户实验室研发,并未得到Roche验证。Roche不保证方案内容和实验成功。Roche主页上展示的客户实验方案只是Roche协助科研团体经验分享。

防止石蜡包埋组织中强特异性信号丧失

为了获得最佳效果,在NBT/BCIP检测后再进行全固封胚胎后固定。

建议在PBS缓冲液中使用3%的多聚甲醇,再加入1%戊二醛。这能避免信号在以后的步骤(比如石蜡化、切片等过程)中减弱。没有固定-显色信号消减最多的步骤就在乙醇冲洗,特别是70%乙醇冲洗步骤。可以使用二甲苯。在固封切片时,推荐有机固封剂,比如Merckoglass,Paramount,Euparal。


 故障排除

棕紫色而非蓝色信号

在原位杂交实验中,NBT/BCIP沉淀信号变化可以从蓝色到棕色,紫色不等。最终的颜色主要取决于组织中目标MRNA丰度,不过也受到探针长度和标记强度影响。检测溶液pH(碱性磷酸酶反应缓冲液)也有一定影响,要仔细调到pH9.5。

一般来说,目标RNA丰度越高,相应信号越强,颜色沉淀为的蓝色更深。如果想要更深的蓝色或紫色信号,可以尝试我们的BM Purple底物。

信号弱

如果探针在凝胶和/或斑点分析中已经被评估过了,应该在northern杂交中也能正常工作。如果ISH检测信号弱,可以优化组织切片质量,全固封制备以及检测过程:

  • 测试不同的探针浓度:测试在杂交混合液中加入更多的探针:比如每50μl杂交溶液中,在50μl 稀释标准反应溶液中1,2,4,8μl 探针。
  • 实验中包含一个强阳性对照
  • 测试另外一个使用氯仿而不是蛋白酶K,甘油的实验方案。

测试不同的标记实验方案也可能有帮助。

:对于DIG原位杂交,很重要的一点是在预处理步骤后以及杂交步骤前,不能让切片变干。切片变干会导致非特异性背景。

心脏样本ISH检测,使用碱性磷酸酶(NBT/BCIP)检测的非特异性“小泡”蓝色背景

心脏和其他组织中可能会积累细胞内脂滴。当在冰冻切片上使用碱性磷酸酶(NBT/BCIP)检测时,一些颜色沉淀会沉积在这些脂滴中。在预杂交前,氯仿切片去脂(10分钟常温),可以解决这个问题。

使用正常的碱性磷酸酶(NBT/BCIP)检测后出现普遍的蓝色背景

使用NBT/BCIP产生非特异性背景可能是组织过度固定造成的。这通常会导致整个组织被染成一片蓝色。这可能无法避免,因为组织可能来自您不可控的来源。这种背景应该不会干扰产生特异性信号。

NBT/BCIP检测缓冲液呈深蓝色且有很多沉淀

检查检测缓冲液的pH值,必须是pH9.5、20℃。尽量避免检测液和空气接触(使用气密性染色缸)。检查浓缩NBT/BCIP储存液中是否有沉淀。当显色底物溶液中出现沉淀,将溶液加热到50℃就能够去除沉淀。如果沉淀没有溶解,使用前将管子离心,因为沉淀可能导致背景出现。离心不会降低总灵敏度。

防止原位杂交实验DIG NBT/BCIP信号淬灭的建议

原位杂交后,通常不会发生NBT/BCIP淬灭。通常淬灭发生在荧光ISH。请注意NBT/BCIP信号玻片不可以用基于二甲苯的固封剂,因为这会导致颜色沉淀结晶。

切片边缘非特异性背景

  • 确保切片在检测过程中没有变干。除了检测过程可能导致这种背景,其他步骤也可能导致这一问题,比如杂交过程。
  • 确保杂交过程中,切片被预杂交/杂交缓冲液完全覆盖。这些步骤中切片变干或体积减少可能时非特异性背景的潜在原因。

为了达到最好的效果:

  • 确保杂交用的盒子完全封闭。
  • 在加湿培养室中操作,杂交盒里需要有和杂交缓冲液中缓冲液和甲酰胺浓度相同的溶液。
  • 在切片上盖上盖玻片,或者使用更为方便的封口膜。
 


 材料