如何选择二抗

以下信息旨在帮助您确定哪种二抗可能最适合您的特定应用。

要问的问题:

  1. 一抗是从哪个物种开发的?
  2. 一抗的种类(同种型)和/或亚类是什么?
  3. 我是否使用亲和纯化抗体或IgG分馏?
  4. 我选择哪种标签?
  5. 我应该在什么情况下使用预先吸附的二抗?
  6. 在什么情况下需要F(ab) 或 F(ab')2 片段抗体?
  7. 我如何破译二抗命名法?

1. 一抗是从哪个物种开发的?

二抗是直接针对一抗种类的抗体。因此,您需要在与一抗的宿主物种不同的物种中产生的二抗。例如,如果您  的一抗是在小鼠中产生的,那么您将需要在山羊、兔子等中培养的抗小鼠二抗。

2. 一抗的种类(同种型)和/或亚类是什么?

在使用单克隆抗体时,这个问题非常重要。然而,多克隆抗体通常是IgG类免疫球蛋白。因此,二抗主要是抗IgG抗体。

单克隆抗体最常在小鼠中开发,偶尔在大鼠、仓鼠或兔子中开发。例如,如果一级单克隆抗体是小鼠IgM,则需要与小鼠IgM反应的二抗(抗小鼠IgM)。  
如果一级单克隆抗体是小鼠IgG亚类之一,则几乎任何抗小鼠IgG二抗都应能与其结合。如果一抗的亚类未知,则可以使用抗小鼠IgG F(ab) 二抗,因为它们识别大多数小鼠免疫球蛋白亚类。 
人和小鼠IgG有许多种类和亚类, 因此二抗的选择可能很困难。然而,这些IgG中的一个共同因素是轻链(κ和λ)。

免疫球蛋白类型和亚类汇总:

         免疫球蛋白种类:IgG,IgM,IgA,IgE,IgD
         人免疫球蛋白亚类:IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2
         小鼠免疫球蛋白亚类:IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3
         轻链:κ,λ
         重链:IgG(γ),IgM(μ),IgA(α),IgD(δ),IgE(ε)

有关抗体反应性的其他信息:

  • 多价:与所有种类反应
  • 抗-Fc和重链特异性:仅与重链反应,因此,它们是种类特异的。
  • 抗-Fab和整个分子特异性:与重链和轻链反应。由于轻链反应性,它们可以与所有种类反应。
  • 轻链(κ、λ)特异性:与所有种类反应,因为所有种类都使用相同的κ或λ轻链。

3. 我是否使用亲和纯化抗体或IgG片段

大多数人更喜欢亲和分离的二抗,因为它们具有最低量的非特异性结合。然而,在某些情况下,可以考虑IgG分馏,即当目标抗原稀少或以低丰度存在时。在这些情况下,需要高亲和力抗体。例如,在亲和分离过程中,可以除去一些非常高亲和力的抗体,因为它们与亲和基质结合得如此紧密,以至于它们不能被洗脱。

为了提高扩增,可以使用两步生物素 / 抗生物素蛋白(亲和素)系统。生物素以非常高的亲和力结合抗生物素蛋白,导致基本上不可逆的相互作用。首先应用生物素化的二抗,然后应用抗生物素蛋白(ExtrAvidin)或与酶或荧光染料偶联的链霉抗生物素蛋白结合生物素化的二抗上的多个位点,从而扩增信号并实现比单独用抗体-酶或抗体-荧光染料缀合物所能达到的更高的灵敏度。

产自驴的高度交叉吸附的抗山羊IgG (H+L) CF™ 568抗体

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