SeqPlex增强型DNA扩增试剂盒(SEQXE)实验方案

产品描述

面向全基因组扩增(WGA)的SeqPlexDNA扩增试剂盒(SEQXE)专用于对极小量或降解/高度片段化的DNA进行下一代测序(NGS)。染色质免疫沉淀(ChIP)或福尔马林固定的石蜡包埋组织样品(FFPE)的DNA含量往往无法满足成功制备下一代测序文库的需求。通过SeqPlex试剂盒可对这类DNA以及其他用于NGS的小量/高度片段化DNA样品进行预扩增。

SeqPlex流程包含三个步骤:预扩增、扩增和引物去除。参见以下SeqPlex工作流程图。

SeqPlex Process Workflow

第一步:预扩增,使用由半简并3 '端和通用5 '端组成的引物复制DNA。随着聚合过程的进行,将置换的单链作为新模板进行额外的引物退火和延伸。预扩增产物由随机的重叠扩增子组成,这些扩增子的侧翼序列为通用末端序列。

第二步:扩增,利用单引物PCR通过通用末端序列对预扩增产物进行扩增。SeqPlex扩增产物范围为200-500个碱基对。来自ChIP的扩增子和/或降解DNA,如FFPE,通常较短并且取决于起始DNA的长度。

第三步:引物去除,从扩增子池中去除引物和半简并序列,使SeqPlex DNA可立即用于NGS工作流程。

 

所含试剂

 

试剂 货号 10 次反应 50 次反应 500 次反应
文库制备缓冲液 LP100 20 µL 100 µL 1000 µL
文库制备酶 E0531 10 µL 50 µL 500 µL
5x 扩增混合液 A5112 235 µL 1.15 mL 11.5 mL
DNA聚合酶 SP300 20 µL 100 µL 1 mL
10x 引物去除缓冲液 SR401 165 µL 825 µL 8.2 mL
引物去除酶 SR402 42 µL 210 µL 2 mL
引物去除溶液 SR400 33 µL 165 µL 1.6 mL
水,分子生物学级别试剂 W4502 5 ml 25 mL 220mL

 

储存/稳定性

所有组分应储存在–20 °C。解冻备用时,可将组分放在冰上。通过短暂加热至37 °C并充分混合,使溶液中的所有沉淀溶解。若储存在–20 °C以上环境或长期放置在4 °C以上环境中,会影响文库制备酶和引物去除酶的稳定性。

 

操作步骤

以下步骤已成功用于扩增和测序100 pg的ChIP分离DNA和100 pg的片段化基因组DNA。受损DNA,如从FFPE组织中分离出来的DNA,可能需要5-10倍的起始DNA量——具体取决于DNA的受损程度。反应可以放大或缩小,以便制备所需数量的扩增DNA。

注:扩增和引物去除后的最终得率很大程度上取决于起始DNA的量。在大部分情况下,可得到1-2μg。多次反应可获得更多产物。

注:该操作步骤是应使用本试剂盒随附或推荐使用的试剂开发的。更换试剂可能无法获得最佳结果。

预扩增

1.为获得最佳的SeqPlex扩增覆盖度和NGS结果,最佳起始DNA大小为200-500bp。许多ChIP和FFPE样品的DNA已经在此范围内。在SeqPlex实验方案的第4步之前,这些样品不需要额外的片段化处理。
如果起始DNA不在200-500 bp范围内,强烈建议进行片段化处理。使用超声处理、Covaris仪器或者酶解法均可将DNA片段化。

2. 尽可能通过紫外吸收(260 nm)测定DNA浓度,并且每个反应最多使用1 ng DNA。
3. 解冻文库制备缓冲液(LP100)、5x扩增缓冲液(A5112)和水(W4502)。充分混匀。
4. 按下述方法添加溶液:
     2 µL文库制备缓冲液(LP100)

     X µL DNA(最多1 ng)

     Y µL水(W4502

    --------------------------------------------------
     14 µL总反应体积


注意—GenomePlex® WGA资深用户:Sigma-Aldrich SeqPlex增强型DNA扩增试剂盒(SEQXE)、SeqPlex DNA扩增试剂盒(SEQX)、GenomePlex WGA试剂盒、Transplex® WTA1试剂盒和完整全转录组扩增试剂盒(WTA2)中的几个组分具有相似的名字。尽管它们的功能相近,但不可互换使用

5.充分混匀,短暂离心,然后在热循环仪中以下列程序孵育:
     95 °C,2分钟

     4 °C,保温

6.样品冷却至4 °C后,加入1 µL文库制备酶(E0531)。盖上管盖并充分混匀。短暂离心并立即进入下一步。

7. 将反应置于热循环仪中并以下列程序孵育:
    16 °C,20分钟
    24 °C,20分钟
    37 °C,20分钟
    75 °C,5分钟
    4 °C,维持

8. 从热循环仪中取出样品并短暂离心。可立即完成扩增或将预扩增产物在-20 °C保存最长3天。

注意—GenomePlex WGA资深用户:
· SeqPlex使用5x扩增混合液

· 推荐使用SYBR Green (S9430)监测扩增过程

· 退火/延伸温度为70 oC

· 扩增后需要在70 oC维持30分钟

9. 在第8步获得的15 mL预扩增产物中加入下列试剂。(多次反应可能需要制备预混液。向每个反应中加入60 mL预混液):
     15 µL 5X扩增混合液(A5112)

     1.5 µL SeqPlex DNA聚合酶(SP300)

     42.5 µL水(W4502)

     1 µL 按1/1000稀释的SYBR Green I (S9430)*

     - µL仪器专用参照染料(可选)

    --------------------------------------------------
     75 µL总反应体积


*为获得最佳结果,强烈建议在实时荧光定量PCR的扩增反应中加入SYBRGreen I,以监测反应进程。为避免抑制扩增反应,SYBRGreen I (S9430)必须稀释1,000倍(1/1000)并且每个75 µl SeqPlex扩增反应仅使用1µl稀释液。除S9430外,其他SYBRGreen配方未经过测试,不推荐使用。


在扩增“平台期”开始后至少2-3个循环时,可达到最佳效果,如图1所示。最佳扩增循环数取决于起始DNA模板的数量和质量。

如果扩增反应不添加SYBRGreen I,使用0.1-1.0 ng高质量DNA通常可在18-24个循环获得良好结果。低质量DNA可能需要更高的起始量和/或更多的循环。如果起始量接近10 pg,则可能需要多达29个循环才能到达扩增平台期。

注:如果达到平台期需要的循环数超过29个,则后续的NGS结果可能会不符合要求。请查看故障排除指南。

 

qPCR Slide
 

10. 充分混匀,并按以下设置在实时荧光定量热循环仪中运行:
初始变性:94 °C,2分钟
循环至平台期开始后的2-3个循环:
     94 °C变性15秒

     70 °C退火/延伸5分钟

    (读取荧光值)

循环后:

     70 °C,30分钟

     4 °C,保温


注:循环后在70°C的延伸孵育对于有效去除引物至关重要。
反应物可立即纯化或先保存在–20 °C。

11. 使用GenElute PCR Clean-Up Kit (NA1020)进行纯化。使用50 µL无核酸酶的水进行洗脱。

12. 通过测量260nm处的吸光度,测定纯化DNA的浓度。一个A260单位相当于50ng/µL DNA。在该点的得率取决于起始DNA的质量,但通常在1-5 µg范围内。
注:其他测量技术,如PicoGreen®,通常会低估实际SeqPlex DNA得率。
在该点,SeqPlex DNA适用于qPCR和基因芯片。为进行深度测序,建议去除SeqPlex引物。
可选:可通过凝胶电泳或毛细管电泳评估扩增质量。一般情况下,毛细管芯片需要1mL[j1] 的粗扩增产物或纯化扩增产物,如Agilent生物分析仪,而琼脂糖凝胶电泳通常需要5 mL[j2] 。

引物去除

注意GenomePlex WGA资深用户:

SeqPlex增强型(SEQXE)引物去除试剂不适用于采用上一代SeqPlex (SEQX)或GenomePlex (WGA1-5)扩增获得的DNA。

为获得足以满足大部分深度测序工作流程需要的产物量(>1μg),建议的反应起始量为2.1 μg。

13.在冰上完成以下试剂添加步骤:

     8.0 µL - 10x引物去除缓冲液(SR401)

     1.6 µL -引物去除溶液(SR400)

     X µL – 2.1 μg纯化SeqPlex DNA

     Y µL –水(W4502)

    --------------------------------------------------
     76.25 µL总反应体积

14.混匀。如果要进行可选的引物去除测定(参见附录1),则取出5 mL[j1] 置于独立试管中,作为“无引物去除酶”对照。

15.向第13步剩余的71.25 µL反应液中加入3.75 µL引物去除酶(SR402)。

16.按以下设置,孵育有酶和无酶反应:

     37 °C,60分钟

     65 °C,20分钟

     4 °C,保温

17.从热循环仪中取出反应物,短暂离心并混匀。反应物可在–20 °C保存最多3天,也可立即纯化。

18. 如果要进行可选的引物去除测定,则在纯化前从“有引物去除酶”反应物中取出5 µL并保存(参见附录1)。

19.按之前第10步所述方法,使用GenElute PCR Clean-up Kit的引物去除酶纯化剩余的反应物。

 

测序

 

SeqPlex DNA现在可立即用于下一代测序工作流程,包括末端制备,但通常不需要片段化或大小筛选。大部分SeqPlex DNA的长度介于200-500个碱基对之间。尽管通常没有必要,但可通过物理或酶解方法进行额外的片段化处理。

去除引物后,每个SeqPlex扩增子末端将具有一个5’-磷酸和一个2-碱基的3 '-突出端。在连接测序引物前,使用T4聚合酶精修双链片段末端。

在引物去除处理后,任何保留引物的SeqPlex扩增子将具有一个5 ' -羟基。无需T4 DNA激酶处理,并且其缺失将减少测序引物与任何残留的未消化SeqPlex引物的连接。

Illumina工作流程中的3 ' -腺苷酸化在很大程度上阻止了连接产物的出现,如嵌合体。嵌合体已被报道出现于Roche 454文库制备和测序中。对于ABI SoLID测序,测序前的二次筛分步骤可能有助于减少嵌合体或串联体。

 

产物分析

 

该试剂盒已被证明可用于扩增ChIP DNA样品和全基因组片段化DNA模板。请注意,高复杂度DNA样品(如ChIP输入DNA)与低复杂度DNA样品(如ChIPed DNA)中的相同序列可能具有不同的扩增程度。因此,最好以复杂度相近的样品进行扩增程度比较,如来自经处理和未处理细胞或肿瘤和正常组织的ChIPed DNA。

SeqPlex DNA已成功用于为采用标准Illumina工作流程方案的Illumina GAIIx和MiSeq制备测序样品,包括:末端制备、精修、扩增和大小筛选。

在将样品用于下一代测序前,我们强烈建议在引物去除后使用已知存在于起始DNA中的短(<300bp)DNA序列的引物进行PCR,以确认SeqPlex DNA的质量。

注:含有5’-CTGAAG-3’或5’-CTTCAG-3’序列的PCR产物或引物在去除引物后不会扩增。

在去除引物后不会扩增的PCR产物实例:

Primer Removal

 

在引物去除之前或之后,SeqPlex DNA中的特定靶点也可通过PCR或基因芯片来确认。

SeqPlex DNA的稳定性与在相同条件下储存的基因组DNA相当。

 

附录 1

可选:引物去除测定

使用5X扩增混合液(A5112)、SeqPlex DNA聚合酶(SP300)和5 µL来自上述第18和14步的“有”和“无引物去除酶”剩余样品,通过qPCR评估引物去除效率。试剂盒提供的5X扩增混合液和DNA聚合酶足以用于每个扩增反应中“有”和“无引物去除酶”样品的引物去除测定。

1.将“有”和“无引物去除酶”样品连续稀释1,000,000倍(如,将1 µL样品稀释于99 µL水中,连续稀释3次)。

2.为上述两个样品制备测定混合液:

     6.6 µL 5X扩增混合液(A5112)

     0.33 µL SeqPlex DNA聚合酶(SP300)

     0.33 µL SYBR Green (S9430)的1/1,000稀释液,稀释剂为水

     3.75 µL水(W4502)

注:每次测定需求体积较小的试剂可以在添加前用水稀释,以避免测量不准确,或者可以为多次检测制备测定预混液。

3.取1,000,000倍稀释的SeqPlex“有”和“无”酶样品各10 µL,分别置于独立的PCR管或孔中。

4.向第3步的两份10 µL1,000,000倍稀释SeqPlex产物中分别加入5 µL来自第2步的测定混合液。

5.按以下设置进行扩增:

     94° C,2分钟

     30 – 35个循环*

     94° C,15秒

     70° C,5分钟(读取)

 如果在至少4个循环时,“有”引物去除酶反应的Ct/Cq值大于“无”酶反应的Ct/Cq值,表明引物去除成功。

 

参考文献

 

故障排除指南

 

观察现象 原因 建议解决方案
扩增后未检测到产物。 退火/延伸温度或时间有误 重新运行反应,条件为每个循环以70 oC退火/延伸5分钟。
扩增期间PCR循环数过少 以更多循环数(最多29个)重新运行反应,并使用SYBR Green监测实时荧光定量热循环仪中的扩增
起始DNA不足或降解过于严重 以更多起始DNA重新运行反应
在实时荧光定量PCR(qPCR)监测期间,未观察到扩增曲线 未添加SYBR Green SeqPlex试剂盒中不包含SYBR Green I(货号S9430),但监测实时荧光定量PCR时必须添加该试剂。
可能需要qPCR仪专用参照染料 加入仪器专用参照染料。如果不能添加参照染料,则应增加循环数以确保完成全部循环。有关其他帮助,参阅FAQ。
引物去除后检测到过多(>60%)或全部SeqPlex DNA丢失 纯化回收率较低 重复消化步骤并使用GenElute PCR Clean-up Kit进行纯化,确保使用5倍体积的结合溶液、使用正确体积的乙醇稀释清洗液并在洗脱前适当干燥洗脱柱。
引物去除酶被核酸酶污染 使用新的引物去除酶(SR402),或者如果无新的分装品可用,购买新的SeqPlex增强型DNA扩增试剂盒(SEQXE)
SeqPlex产物浓度过低,未达到检测方法要求 使用特定qPCR引物以及在引物去除前用SeqPlex DNA绘制的标准曲线,估算引物去除后的SeqPlex浓度。 注:模板中包含5’-CTGAAG-3’或5’-CTTCAG-3’的引物在引物去除后不可用于PCR。
引物去除前的PCR检查是成功的,但引物去除后的PCR检查失败 用于PCR检查的引物扩增的目标序列在引物去除期间被切割 选择侧翼区域不含5’-CTGAAG-3’或5’-CTTCAG-3’的PCR引物进行扩增。
SeqPlex DNA在引物去除期间完全降解。 参见上文“引物去除后检测到过多(>60%)或全部SeqPlex DNA丢失”部分
NGS后效果不佳 SeqPlex起始DNA未切割至200-500bp 在开始SeqPlex流程之前,根据需要确认起始DNA的大小和片段。
SeqPlex扩增的循环数不足 监测扩增循环和并在平台期后继续运行2-3个循环。如果监测完全失败,则可使用默认29个循环。
NGS IVC异常 IVC图显示,多个读取片段中的前几个核苷酸具有相同序列(引物) 通过对不含SeqPlex DNA的通道进行均一化处理,可实现最佳的仪器簇检出。

 

常见问题

1. SeqPlex DNA是否可用于基因芯片和qPCR?

可以,有或无引物去除的SeqPlex DNA均可用于这些应用,如基因组DNA或现有的GenomePlex产品。

2. 如果不需要去除引物,那么SeqPlex比GenomePlex还有哪些优势?

SeqPlex预扩增引物比现有GenomePlex WGA引物的靶向性更强,因此对于某些区域具有更高的基因组覆盖度,这是它的优势。

3. 减少扩增过程的循环数是否能改善结果?

不能,在“平台期”后至少运行2-3个循环,可达到最佳效果。循环不足将导致效果/覆盖度显著降低。

4. 如果无法通过实时荧光定量PCR监测扩增循环,那么应该运行多少个循环?

当无法通过监测确定最佳循环条件时,建议进行过度循环。对于100 pg-1 ng ChIP样品,24个循环是足够的。对于小于100 pg或质量较差的输入样品,29个循环是足够的。

5. 去除引物后剩余的SeqPlex引物是否会干扰下一代测序仪簇检出?

不会,含有极少量残余引物的SeqPlex DNA将在Illumina GAIIx和MiSeq仪器上产生优质的序列。为获得最佳的SeqPlex DNA簇检出,请参阅“NGS IVC异常”的故障排除指南。

6. SeqPlex引物去除酶是否会去除全部SeqPlex引物?

会,SeqPlex引物去除酶可去除完整的引物,但消化可能不是100%完成。

7. SeqPlex引物的所有拷贝是否会被完全去除?

可能会残留少量的完整SeqPlex引物。大部分SeqPlex DNA(>90%)将完全去除SeqPlex引物。

8. 预期得率是多少?

得率变化很大,取决于多种因素。以100 pg of ChIP DNA为起始物料,预计每个引物去除反应可获得约1-5 ug扩增产物和1-3 µg 可立即用于NGS文库制备的SeqPlex DNA。

注:预计引物去除将减少多达50%的产物。因此,如果测序需求量大于1 μg,则应进行多次独立的2 μg引物去除反应。

9. GenomePlex扩增试剂盒(WGA3)是否可与SeqPlex一起使用?

不可以,引物去除前后的SeqPlex DNA与GenomePlex再扩增试剂盒不兼容。其引物序列不同。

SeqPlex DNA是否需要特殊的NGS测序方案?

不需要,SeqPlex DNA可直接用于NGS工作流程,就像ChIP DNA一样。应告知测序仪操作人员直接运行SeqPlex DNA,并预期IVC图中将出现残留引物的微弱信号。

 

材料