尺寸排阻色谱柱填充和制备

附录1,摘自尺寸排阻色谱原理和方法(PDF),GE Healthcare,2014

填充良好的层析柱对于在任何SEC介质上进行高分辨率组分分离都必不可少。GE Healthcare的预装柱可确保结果重现性和高性能。如果预装柱的柱容量或介质不合适,请与您当地GE Healthcare销售代表联系,询问我们的柱填充服务。

在任何SEC实验中,填充柱子都是一个极其关键的阶段。填充不好会导致流动不均匀、峰增宽和分辨率降低,还会影响原本可达到的流速。如果您决定自己动手填装,那么本附录中的指南将适用于任何规模的操作。

附带指导视频光盘可以演示如何制备一个填充良好的柱子(请参阅视频中关于柱填充的订购信息)。它重点强调了柱填充对于凝胶过滤的重要性。一旦填充良好,SEC就很容易开展。只要悉心使用和维护,就可以长期确保可重复的高分辨率结果。

确保有足够的缓冲液来进行长时间、无人看管的操作,或者将泵设定为在适当的时间后将停止供液。流空柱子必须重新填充。


 用于填充SEC介质的柱子

GE Healthcare的空柱与先进介质实现的高流速以及广泛的规格尺寸完全兼容。有关空柱子和主要附件的订购信息见手册背面。

表 A1.1.XK柱使用一到两个接头时最大柱床高度(cm)和柱床体积

 

  一个接头                 两个接头
体积 (ml) 柱床高度 (cm) 体积 (ml) 柱床高度 (cm)
XK 16/20 5 - 31 2.5 - 15.5 0 - 31 0 - 15.5
XK 16/40 45 - 70 22.5 - 35 16 - 70 8 - 35
XK 16/70 105 - 130 52.5 - 65 76 - 130 38 - 65
XK 16/100 165 - 190 82.5 - 95 136 - 190 68 - 95
XK 26/20 5 - 66 1 - 12.5 0 - 66 0 - 12.5
XK 26/40 122 - 186 23 - 35 45 - 186 8.5 - 35
XK 26/70 281 - 344 53 - 65 204 - 344 38.5 - 65
XK 26/100 440 - 504 83 - 95 365 - 504 68.5 - 95
XK 50/20 0 - 274 0 - 14 0 - 274 0 - 14
XK 50/30 265 - 559 14 - 28 0 - 559 0 - 28
XK 50/60 794 - 1088 40 - 56 500 - 1088 26 - 56
XK 50/100 1588 - 1862 81 - 95 1274 - 1862 65 - 95

 

接头是可调节的柱底部配件,有助于在使用样本时消除样本对于填充好的介质表面的任何干扰,并防止不溶颗粒进入并阻塞柱子。

Tricorn和XK空柱带有一个接头,但是如果需要更短的柱床高度,可以使用第二个接头代替底部配件。HiScale™ 柱带有双接头。所有的空柱子均有一系列附件可选。
 

表 A1.2.Tricorn柱的柱床体积和高度

 

    一个接头                 两个接头
Tricorn柱 柱编号(mm) 体积 (ml) 柱床高度 (mm) 体积 (ml) 柱床高度 (mm)
Tricorn 10/20 10 0.00 - 2.29 0 - 29 0.00 - 2.07 0 - 26
Tricorn 10/100 10 6.21 - 8.57 79 - 109 3.64 - 8.36 46 - 106
Tricorn 10/150 10 10.14 - 12.50 129 - 159 7.57 - 12.28 96 - 156
Tricorn 10/200 10 14.07 - 16.42 179 - 209 11.50 - 16.21 146 - 206
Tricorn 10/300 10 21.92 - 24.28 279 - 309 19.35 - 24.06 246 - 306
Tricorn 10/600 10 45.48 - 47.84 579 - 609 42.91 - 47.63 546 - 606

 

 表 A1.3.HiScale柱的柱床高度和体积

 

带一个接头的最大柱床高度(cm)和最大柱床体积(ml)
HiScale 16/20 20 cm, 40 ml
HiScale 26/20 20 cm, 106 ml
HiScale 16/40 40 cm, 80 ml
HiScale 26/40 20 cm, 212 ml
HiScale 50/20 20 cm, 393 ml
HiScale 50/40 20 cm, 785 ml


较长的柱子(50 cm更多)在一般的实验室条件下很难填充。作为替代方案,使用我们的柱填充服务或连接两个或两个以上的短柱(柱床高度为20或30cm),可实现所需的柱床高度。


 检查柱效

建议通过确定每米理论塔板数和峰对称性来定期检查层析柱性能。注意,柱效的结果取决于所使用的系统,包括毛细管和死体积。这就意味着柱子说明书中给出的柱效(在另一个系统上测试得到)将与您最初的柱效结果不同。

柱子性能的一些常见参数:
Superdex 预装级:效率 N/m > 10 000, 峰对称性 As = 0.70 到 1.30 聚丙烯酰胺葡聚糖 HR:效率 N/m > 9000, 峰对称性 As = 0.80 至 1.50

  1. 按照操作说明中建议的流速用蒸馏水平衡预装柱。
  2. 将丙酮(20 mg/ml溶于水)注入,使其体积相当于填充柱总体积的0.2%。
  3. 从注射到洗脱处丙酮峰及信号恢复到基线,监测紫外吸收280 nm。
  4. 计算柱效,即每米理论板数(N/m):

N/m = 5.54 (Ve / W1/2)2/L
其中
Ve = 峰洗脱 (滞留) 体积
W1/2 = 半峰高时的峰宽度
L = 柱床高度 (m)
Ve 和 W1/2 为相同单位

计算偏度系数 (As):
As = b/a
其中
a = 10%峰高时的第一个峰宽度
b = 10%峰高时的第二个峰宽度

用理论板数和峰对称性确定柱效


图 A1.1.
用理论板数和峰对称性确定柱效。

采用Superdex 预装级和Sephacryl高分辨率组分分离柱填充

Superdex级和Sephacryl高分辨率介质应使用XK系列的柱在高流速下进行填充和平衡。XK柱是专为SEC优化设计的。

柱床的设计确保了液体的均匀流动和柱出口的死腔小于柱体积的0.1%,以最小化稀释及防止分离峰的再混合。XK柱由对不稳定生物物质无干扰的材料制成。它们易于拆卸和重新组装,便于彻底清洗,这在处理生物样品时尤为重要。

确保柱和所有部件均干净并完好。尤为重要的是网,网紧固件和玻璃管均没有损坏。使用完全脱气的缓冲液,并将所有材料平衡到分离所需的温度。避免使用较大死体积的柱子,因为这会影响分辨率。

对于高分辨率的组分分离,使用30 - 60cm的柱床。所用样品体积相当于柱体积1%至2%。如果在特定的应用中分辨率足够好,样品体积可以增加到4%。

沉降介质的体积应是所需填充柱体积的1.15倍,如表A1.1 - A1.3所示。

  1. 供应的Superdex 预装级和Sephacryl HR在含有20%乙醇作为防腐剂的悬浮液中使其膨胀。轻轻摇晃,将介质悬浮起来,然后倒入量筒或烧杯中。
    避免使用磁性搅拌器,抹刀或玻璃棒,因为它们会破坏介质。
  2. 用5 - 10倍柱体积蒸馏水在玻璃过滤器上清洗介质,然后重新悬浮在蒸馏水中,使沉淀介质的终浓度为50%。须彻底清洗培养基,以除去20%乙醇的储存溶液。残留的乙醇会干扰后续的步骤。
    为产生更均匀的Superdex预装级分散悬浮液,可以添加Tween? 20(每500 ml清洗后的悬浮液中含250 ml)以降低表面张力。
  3. 通过废水管注入蒸馏水,润湿底部过滤器。关闭底部附件出口。将过滤器和底端件安装在柱上。
  4. 将填料槽紧固在柱上。
    对于XK 16和XK 26,使用第二个柱子替代填料槽可以更容易地获得填充良好的柱。根据具体情况,将第二个柱子与XK 16或XK 26的填充连接器一起使用。
  5. 将柱和填料槽垂直安装在实验台上。
  6. 向柱端部上方2cm处注入蒸馏水。避免产生气泡。
  7. 在真空下对悬浮介质脱气,用玻璃棒小心地将悬浮介质沿柱壁加入。避免产生气泡。一次性倒入所有的东西,然后用蒸馏水将槽注满。
  8. 将泵出口连接到填料储槽的入口。打开柱出口,开始流动缓冲液,流量建议见表A1.4。
    为了达到满意的柱效,Superdex 预装级必须分为两个步骤:步骤1持续2 hour或直到柱床达到恒定高度,步骤2持续60 min。表A1.4显示了每一步的流速。
    Sephacryl HR通常只使用表A1.4第2步中给出的较高的流速就可以达到满意的填充效果。如果初次装柱效果不理想,则采用两步法。
  9. 停止泵并拆卸填料槽。用蒸馏水仔细填充柱子,在顶部形成向上的弯月面,并插入接头。将接头调整到填充柱床的表面。
  10. 继续按照步骤2中使用的流速对柱进行填料填充,持续大约10min。如果无法获得推荐流速,则使用泵所能提供的最大流速。在填充介质的顶部位置作标记,停止泵,关闭柱出口,将接头向下移动到介质表面,然后将接头再向前推深入到介质中3 mm。填充柱即可使用了。Sephacryl HR和Superdex p预装级介质的最大推荐流量和操作压力见表A1.4。
    填充时不要超过最大压力:Sephacryl S-300 HR和S-100 HR分别为0.2至0.4MPa, 2至4 bar;Sephacryl S-400 HR和S-500 HR为0.15MPa, 1.5bar;Superdex prep grade (75 and 200)为0.4至0. MPa,4至5bar。经常检查产品附带的特定存储说明。
     

表 A1.4.柱填充时的建议流速

 

  柱床高度 (cm) 步骤1 Sephacryl HR (ml/min) 步骤2 Sephacryl HR (ml/min) 步骤1 Superdex prep grade (ml/min) 步骤2 Superdex prep grade (ml/min)
XK 16/40 35 1 - 2 2 - 4 1 - 2 4 - 6
XK 16/70 65 1 - 2 2 - 4 1 - 2 4 - 6
XK 16/100 95 1 - 2 2 - 4 1 - 2 4 - 6
XK 26/40 35 2 - 4 4 - 8 2 - 4 10 - 14
XK 26/70 65 2 - 4 4 - 8 2 - 4 10 - 14
XK 26/100 95 2 - 4 4 - 8 2 - 4 10 - 14
XK 50/20 10 - 15 8 - 10 4 - 8 9 - 11 19 - 21
XK 50/30 20 - 25 8 - 10 4 - 8 9 - 11 19 - 21
XK 50/60 55 8 - 10 4 - 8 9 - 11 19 - 21
XK 50/100 95 8 - 10 4 - 8 9 - 11 19 - 21


 使用Sephadex进行分组分离的柱填充

Sephadex以干粉形式提供,在使用前必须在过量的缓冲液中进行膨胀。膨胀后,用缓冲液调整而形成一层浓稠的悬浮液,在真空下除去其中的气泡。沉淀介质的合适占比大约为75%。细小的颗粒可以倒出。

使用沸水浴可加速膨胀过程(表A1.5)。这也有助于悬浮液的脱气。使用前使悬浮液冷却。

表 A1.5.Sephadex柱床体积体积和膨胀时间

 

介质 大概的柱床体积 
(ml/1 g 介质)
膨胀时间 (h), 20°C 膨胀时间 (h), 90°C
Sephadex G-10 Medium 2 to 3 3 1
Sephadex G-25 (all grades) 4 to 6 3 1
Sephadex G-50 Fine 9 to 11 3 1

 

确保柱和所有部件均干净并完好。尤为重要的是网,网紧固件和玻璃管均没有损坏。使用完全脱气的缓冲液,并将所有材料平衡到分离所需的温度。将填料柱放置在远离通风或阳光直射的地方,以免引起温度变化和气泡的形成。

对于分组分离,使用高达10cm的柱床。使用相当于柱体积30%的样品体积。填充适量的介质,其体积可达脱盐样品体积的五倍。

注意:这些说明假定使用带有两个接头的柱子进行填充。

  1. 称出适量的干Sephadex,根据上面的说明使介质膨胀。避免使用磁性搅拌器,抹刀或玻璃棒,因为它们会破坏介质。
  2. 通过废水管注入蒸馏水,润湿底部过滤器。关闭底部附件出口。将过滤器和底端件安装在柱上。
  3. 如果悬浮液体积大于柱的体积,则在柱上附加一个填料槽。
  4. 将柱和填料槽垂直安装在实验台上。
  5. 向柱端部上方约2cm处注入蒸馏水或缓冲液。避免气泡。
  6. 用一根玻璃棒将混合良好、脱气良好的悬浮液一次性倒入柱内。避免产生气泡。
  7. 将泵出口连接到填料储槽的入口。打开柱出口,缓冲液即开始流动。为了充分平衡柱床,使用至少2至3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。使用比分离流速稍高的流速。
  8. 在柱床高度不变的情况下,保持至少3个柱体积的填料流量。
  9. 在柱子上标记柱床高度,并关闭柱子出口。拆卸填料槽。
  10. 用缓冲液仔细填充柱子,在顶部形成向上的弯月面。
  11. 连接各种管路。松开转接器紧固装置,将转接器以一定角度插入柱内,使网内无空气滞留。将接头缓慢地滑下柱子,直到达到标记位置。请注意,接头的出口应该是打开的,柱出口应该是关闭的。
  12. 调整紧固装置,使柱壁与O形环之间形成滑动密封。将接头拧至柱上。
  13. 继续对柱进行大约10min的填充。停止泵,关闭柱出口,并将顶部接头向下移动到介质表面。将接头再向前推深入到介质中3 mm。填充柱即可进行平衡了。

Sephadex G-10, G-25, and G-50均符合达西定律,即如果流速增加一倍,柱压就会增加一倍,因此无需考虑流速或操作压力的最大值(见附录 2关于达西定律的解释)。
 

柱填充

图 A1.2.柱填充-影片提供了o分步演示柱填充。


 控制流速

在柱填料和色谱分离过程中最安全、最简单的控制流速的方法是使用AKTA色谱系统控制的泵。准确和可重现的流量控制对于高效的柱填料和重复实验或执行常规制备工作尤为重要。蠕动泵可用于Sephadex填充的小柱子中。

最大流量取决于柱径和缓冲液粘度。窄柱比宽柱允许更高的压力和更高的线性流速(cm/h)。

始终使连接的泵是将缓冲液泵到柱子上(而不是在柱后连接泵抽走柱子中的缓冲液)。这降低了由于吸力作用而形成气泡的风险。

在进行柱填充时,始终采用比用于分离的流量较高的流速。

不要超过介质压力或线性流的最大推荐值。超过这些值可能会导致介质在分离过程中压缩并降低流速及分辨率。

分离过程中的流速不要超过柱填充流速的75%。

在大柱中填充Superdex或Sephacryl介质时,不要使用蠕动泵,因为流速高到无法获得高分辨率的组分分离。


 材料