利用Sephacryl®进行分离

摘录自 尺寸排阻色谱原理及方法(PDF)
GE Healthcare, 2014

缓冲液:50 mM磷酸钠,150 mM氯化钠(pH 7.2),或另选可储存或溶解样品进入下一步的缓冲液。

使用150 mM氯化钠或具有相同离子强度的缓冲液,以避免pH依赖性非离子与基质的相互作用。在离子强度非常低的情况下,少量带负电荷基团存在会导致碱性蛋白质阻滞和酸性蛋白质排阻。

样品应完全溶解。离心或过滤以去除颗粒物质(见附录3)。请务必使用脱气缓冲液并在运行期间保持恒定温度,以避免将空气引入色谱柱(见表1.3

在色谱系统上设置适当的压力限制,以避免损坏色谱柱填料。高粘度溶液和低温情况下,应采用较低的流速

 

首次使用或长期储存后

  1. 用至少0.5倍柱体积的蒸馏水以15 cm/h进行柱平衡(16/60柱采用0.5 ml/min,26/60柱采用1.3 ml/min)。
  2. 用2倍柱体积的缓冲液以30 cm/h进行柱平衡(16/60柱采用1.0ml/min,26/60柱采用2.6ml/min)。
  3. 将流速降低至15 cm/h,为了实现最佳的分辨率,加入等同于1%柱体积的样品(16/60柱为1.2 ml,26/60柱为3.2 ml)。样品体积可在0.5%至4%之间。
  4. 用1倍柱体积的缓冲液进行洗脱。
  5. 在加入新的样品前,用1倍柱体积的缓冲液以30 cm/h进行柱的重新平衡,直至在A280监测到的基线稳定。

应通过确定每米的理论塔板数和峰对称性,定期检查色谱柱性能。 预包装色谱柱提供有相应的建议值。关于如何检查色谱柱效率,参见附录1

参见第1章获取优化分离的建议。

色谱柱暴露在4°C至40°C范围之外的温度会对预装床的效率产生负面影响,需要对色谱柱重新填料。

 

清洁

  1. 用0.5倍柱体积的0.2 M氢氧化钠以15 cm/h的流速(16/60柱采用0.5 ml/min,26/60柱采用1.3 ml/min)进行清洗,去除绝大多数非特异性吸附的蛋白。
  2. 立即采用2倍体积的缓冲液进行重新平衡,直至在A280监测到的基线稳定且洗脱液pH稳定。

如果缓冲液含有去垢剂,则可能需要更进一步的平衡。

建议每10至20次分离后便进行常规清洁,但清洁频率还取决于所用样品的性质。

如果需要,可以在121°C, pH 7条件下反复高压灭菌Sephacryl HR 30分钟,前提是不要显著影响其色谱性质。必须从色谱柱中除去介质,因为高压灭菌会损坏色谱柱成分。请注意,HiPrep柱无法重新填料。

为了去除严重的污染物

可采用以下方案在室温条件下进行逆向流动并以10 cm/h(16/60柱采用0.3 ml/min,26/60柱采用0.8 ml/min)的流速进行清洗:

  1. 先后用0.25倍柱体积的0.5 M氢氧化钠(以去除疏水性蛋白或脂蛋白)和4倍柱体积蒸馏水进行清洗。
  2. 先后用0.5倍柱体积的30%异丙醇(以去除脂质和极疏水性蛋白)和2倍体积蒸馏水进行清洗。

针对极端污染的情况,请查阅产品随附的说明书。

对填充Sephacryl®介质的色谱柱采用逆向流动的方法,在严重污染的情况下才可使用。逆向流动会引起穿过填充床的通道分辨率及效率下降,需要对柱进行重新填料。经专业填充的色谱柱更不易受影响,但也要格外小心。

 

 

材料