使用Superdex进行分离

摘自 尺寸排阻层析原理和方法, (PDF)
GE Healthcare, 2014

缓冲液:10至50 mM磷酸钠,150 mM氯化钠,pH 7.0至7.4;或选择用来在下一步骤前存储或溶解样品的缓冲液。

使用150 mM氯化钠或具有相同离子强度的缓冲液,以避免pH依赖性离子与基质的相互作用。在非常低的离子强度下,基质上存在少量带负电荷的基团可导致碱性蛋白质的阻滞。

样品应完全溶解。离心或过滤以去除颗粒物(见附录3)。始终使用脱气缓冲液并在运行期间保持恒定温度,以避免将空气引入层析柱。

 

在层析系统上设置适当的压力限制,以避免损坏层析柱填料。

首次使用或长期储存后

  1. 用2倍柱体积的水平衡层析柱以去除储存溶液。使用低流速(表2.3)避免形成任何间隙。
  2. 首次使用:根据层析柱压力限值设置(第1章)一节确定层析柱的特定压力限值。
  3. 执行柱效测试(参见附录1)。
  4. 在运行期间,用2倍柱体积含150 mM氯化钠的缓冲液平衡柱(表2.2)。
  5. 使用相当于柱体积的0.5%至4%的样品体积。对于大多数应用,样品体积不应超过2%以达到最大的分辨率(3.2 / 300 GL和5/150 GL最多50μl,10/300 GL最多500μl,HiLoad 16/600最多2.4 ml,HiLoad 26/600最多6.4 ml)。请注意,小样品上样量可提高分辨率。
  6. 用1倍柱体积的缓冲液洗脱。
  7. 在进样新样品前,用缓冲液重新平衡层析柱,直到A280监测的基线平稳。
  8. 应通过确定每米理论塔板数和峰对称性,定期检查层析柱性能。
  9. 有关如何检查层析柱效率,请参见附录1
  10. 有关优化分离效果的建议,请参阅第1章。请确保不超过层析柱的压力限制并考虑限制流速(表1.3)。当在低温下工作时(如在冷室中),或当柱子与20%乙醇或其他粘稠溶液一起使用时,这点尤其重要。暴露在4°C至40°C范围之外的温度会对填充床的效率产生负面影响,并且层析柱可能需要重新灌柱。

 

表2.3. 在使用预装Superdex Increase、Superdex的层析柱,或装有制备级Superdex 填料的HiLoad层析柱时,不同阶段推荐的流速

 

室温下的流速

 

  3.2/300 GL 5/150 GL 10/300 GL HiLoad 16/600 HiLoad 26/600
首次使用或长期储存后 0.05 ml/min 0.3 ml/min 0.5 ml/min 1 ml/min*
(30 cm/h)
2.6 ml/min*
(30 cm/h)
首次使用或长期保存后(Superdex 200 Increase) 0.075 ml/min 0.3 ml/min 0.75 ml/min N/A N/A
原位清洗,CIP 0.02 ml/min 0.3 ml/min† 0.5 ml/min 0.8 ml/min
(25 cm/h)
2.2 ml/min
(25 cm/h)


* HiLoad:为了节省时间,可以使用更高的流速进行缓冲液平衡:HiLoad 16/600和HiLoad 26/600分别可设置为1.6 ml / min和4.3 ml / min。在进样之前,将流速降低到建议的流速。

†Superdex 200 Increase 5/150 GL的流速为 0.13 ml/min。



清洗

1.  用1倍柱体积的0.5 M氢氧化钠或0.5 M乙酸进行清洗。在整个CIP程序中应使用低流速(见表2.3)。

2.  立即用1倍柱体积的蒸馏水清洗,然后用至少2倍柱体积的缓冲液清洗,直至A280监测基线和洗脱液的pH值保持稳定。

如果缓冲液含有表面活性剂,则可能需要进一步的平衡。

建议每10至20次分离后进行常规清洗,但清洗频率还取决于所用样品的性质。

 

 

去除严重污染

1. 改变流向。

2. 用4倍柱体积的1 M NaOH(以除去疏水性蛋白质或脂蛋白)清洗,然后用4倍柱体积的蒸馏水清洗。

3. 用0.5倍柱体积的30%异丙醇清洗以除去脂质和非常疏水的蛋白质,然后用2倍柱体积的蒸馏水洗涤。

4. 用至少5个柱体积的缓冲液平衡层析柱,或直至A280监测基线和洗脱液的pH值保持稳定,然后开始新的分离。

对于极端的污染情况,请查看产品随附的说明。

 

材料