标准PCR

 标准PCR的引言

Taq DNA聚合酶是一种来自嗜热细菌栖热水生菌的热稳定酶。该酶是重组形式,在大肠杆菌中表达。它能够承受反复加热至95°C而不会显著损失活性。通过SDS-PAGE测定,该酶约为94 kDa,没有可检测的核酸内切酶或核酸外切酶活性。它具有5'→3' DNA聚合酶活性以及5'→3'核酸外切酶活性。每批Taq DNA聚合酶都经过PCR扩增和双链测序测试。该酶以5单位/μL供应,并配有优化的10x反应缓冲液。

单位定义:一个单位在74℃下在30分钟内将10 nmol的总脱氧核糖核苷三磷酸酯结合到酸可沉淀的DNA中。

 

 标准PCR的试剂

根据用户的偏好选择Taq DNA聚合酶:
 

标准Taq DNA聚合酶
含有MgCl2 单独的MgCl2 Readymix - 与缓冲液和dNTP预先混合的PCR预混液
不含染料的透明配方 含有红色染料,供直接上样到凝胶 不含染料的透明配方 含有红色染料,供直接上样到凝胶 不含染料的透明配方
来自Thermus aquaticus(D1806)的Taq DNA聚合酶 REDTaq®DNA聚合酶
D4309
来自Thermus aquaticus的Taq DNA聚合酶,不含MgCl2(D4545 REDTaq® ReadyMix™ PCR反应混合液
R2523
ReadyMix™ Taq PCR反应混合液
P4600

 

  • PCR级纯水(W1754
  • 稀释至工作浓度的引物(10 μM工作原液足以进行大多数分析)
  • 寡核苷酸 → 在此订购定制的寡核苷酸
  • 待扩增的DNA
  • 专用移液器
  • 热循环仪
  • 无菌过滤器移液器吸头
  • 无菌1.5 mL螺纹盖微量离心管(例如CLS430909
  • PCR管,选择以下一种以匹配所需的形式:
  • 单个薄壁200 μL PCR管(Z374873P3114
  • 条纹管,200 uL(Z374962
  • 96孔板(Z374903
  • 384孔板(Z374911
  • 板封
  • AlumaSeal® 96薄膜(Z721549
  • dNTP混合液,dATP、dCTP、dGTP、dTTP每种10 mM(D7295,readymixes不需要)

 关于标准PCR的相应步骤

Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物和MgCl2浓度的最佳条件取决于所用的系统。可能有必要确定每个单独组分的最佳条件。对于Taq DNA聚合酶、循环参数和MgCl2浓度尤其如此。建议滴定酶和MgCl2以确定最佳效率。

1. 选择合适的反应设置表:标准试剂或预混试剂。按照表中给出的顺序将试剂添加到适当大小的试管中。对于大量的反应,应设置不含模板的预混液,并将其等分到反应管中。最后,应将模板添加到适当的管中。

标准PCR反应
 

数量 组分 最终浓缩
w µL  
5 µL 10x PCR缓冲液(P2192、B5925或P2317)* 1x
1 µL* 脱氧核苷酸混合液 200 µM
w µL 正向引物
(通常长度为15-30个碱基)
0.1-0.5 µM
x µL 逆向引物
(通常长度为15-30个碱基)
0.1-0.5 µM
0.5 µL Taq DNA聚合酶(D6677或D5684)* 0.05单位/µL
y µL 模板DNA(通常为10 ng) 200 pg/µL
z µL 25 mM MgCl2(仅与缓冲液P2317一起使用) 0.1-0.5 mM
50 µL 总反应物体积

*注意:列出的组分是以D1806D4309D4545销售的试剂

 

Readymix PCR反应
 

数量 组分 最终浓缩
25 µL Readymix(R2523P4600  
w µL 正向引物
(通常长度为15-30个碱基)
0.1-0.5 µM
x µL 逆向引物
(通常长度为15-30个碱基)
0.1-0.5 µM
y µL 模板DNA(通常为10 ng) 200 pg/µL
z µL  
50 µL 总反应物体积

2. 轻轻涡旋混合并短暂离心以收集试管底部的所有组分。

3. 如果使用没有加热盖的热循环仪,则向每个试管的顶部添加50 μL矿物油以防止蒸发。

4. 扩增参数会随所使用的引物和热循环仪的不同而不同。可能需要针对具体的引物、模板和热循环仪优化系统。

典型的循环参数
 

建议进行25-30个循环的扩增
变性模板 94 °C 1min
退火引物 55 °C 2 min
延伸 72 °C 3 min

5. 扩增的DNA可以用琼脂糖凝胶电泳和随后的溴化乙锭染色来评估。可以通过单次氯仿提取(1:1)除去矿物油覆盖层,回收水相。

 

 参考文献

  1. Cheng, S., et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5695-5699 (1994).
  2. Chou, Q., Nucleic Acids Res. 20, 4371 (1992).
  3. Innis, M.A., et al. (Eds.)  PCR Strategies, Academic Press, New York (1995).
  4. Innis, M., et al. (Eds.)  PCR Protocols:  A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, California (1990).
  5. Innis, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9436-9440 (1988).
  6. Newton, C.R.  (Ed.)  PCR: Essential Data, John Wiley & Sons, New York (1995).
  7. Olive, D., et al., J. Clin. Microbiol. USA 27, 1238 (1989).
  8. Paabo, S., et al., Nucleic Acids Res. 16, 9775-9787 (1988).
  9. Saiki, R., PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton, New York (1989).
  10. Sambrook, J, et al.  Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2000) . Catalog No. M8265.
  11. Sarkar, G., et al., Nucleic Acids Res. 18, 7465 (1990).
  12. Winship, P.R., et al., Nucleic Acids Res. 17, 1266 (1989).

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