标准逆转录方案(两步法)

逆转录

逆转录 (RT) 是利用逆转录酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)将核糖核酸(RNA) 转化为互补脱氧核糖核酸(cDNA)的过程。

可以对总 RNA 进行 RT 步骤,从而产生代表样品中所有 RNA 转录物的全部 cDNA(通常通过两步法方案),或者通过基因特异性方法,从而只将感兴趣的 RNA 转化为 cDNA(通常遵循一步法方案)。

下面的实验可以作为基本的 RT 方案,可以修改以适应特定的要求。通常采用两步法制备 cDNA,随后将 cDNA 稀释后加入聚合酶连锁反应/定量即时聚合酶链锁反应(PCR/qPCR)中,或者采用两个过程依次进行的一步法反应。


 设备

  • 标准 PCR 仪或加热块
  • 用于 RT 设置的层流罩(选配)


 试剂

  • RNA(原液约 1 μg/μL)。
  • ReadyScript®  两步 cDNA 合成试剂盒 ( RDRT )。可选逆转录试剂盒也可与 oligo-dT 引物和/或随机引物联合使用。
  • PCR 级水:PCR 级水(  W1754   或    W4502 ),20 mL 等分试样;冻结;每次反应使用新鲜的等分试样。


 供应品


 方法

准备

  1. 将 ReadyScript®  试剂盒组件和 RNA 样品置于冰上。
  2. 在混合后短暂地进行离心,收集管底部的内容物。

反应

  1. 确定所需的反应(包括控制)数量。根据表 P10-26 计算所有反应所需各组分的体积(移液误差允许额外增加 10%),并使用 0.2 mL 试管或 96 孔板置于冰上合并试剂。如果使用 PCR 板,请按照板示意图进行操作,以确保将试剂添加到正确的孔中。

    表 P10-26。ReadyScript®  cDNA 合成反应主混合物。

    试剂 每次 20 μL
    反应的体积 (μL) 
    ReadyScript®  cDNA 合成混合物(5×RT 混合物) 4
    总 RNA 模板 — 可变(1µg 至 10 pg) 1
    PCR 级水 15

     

  2. 将每个反应密封后,轻轻进行涡旋以混合内容物。短暂离心收集 反应管底部的组分。

  3. 根据 表 P10-27 培育反应混合物。

    表 P10-27。ReadyScript® cDNA 合成反应温度培育曲线

    温度 (°C) 时间(分钟)
    25 5
    42 30
    85 5
    4 待定

     

  4. cDNA 合成完成后,用 1:5~1:10 的第一链反应 (2—4 μL) 进行 PCR 扩增。

    注意: 使用 ReadyScript® 试剂时,可在 PCR 中加入 2–4µL 未稀释的 cDNA,而不会引起抑制。 如果需要,cDNA 产物可用 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)和0.1 mM EDTA 稀释,在 -20°C 保存。


 材料